劉興茂，葉玲玲，劉紅，李世崇，王啟偉，吳本傳，陳昭烈

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

應(yīng)用全基因表達譜芯片考察哺乳動物細胞在培養(yǎng)過程中的基因表達譜，不僅可以反映調(diào)控細胞生長、代謝、增殖、凋亡的相關(guān)信號通路的關(guān)鍵基因表達狀態(tài)，而且可以揭示細胞生長代謝動力學(xué)變化的內(nèi)在原因，為細胞培養(yǎng)過程的優(yōu)化控制提供理論依據(jù)[1-4]。近年來，隨著基因組學(xué)和蛋白組學(xué)研究的拓展和深入，DNA芯片技術(shù)及蛋白組芯片技術(shù)越來越廣泛地用于考察哺乳動物細胞自身及其在不同細胞培養(yǎng)工藝條件下的基因表達差異[5-8]。

批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)是哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)體系中的兩種最為常用的操作模式[9-10]。批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)過程中營養(yǎng)成分耗竭和代謝產(chǎn)物積累等環(huán)境因素的變化，必將影響到細胞周期調(diào)控基因的表達，進而對培養(yǎng)細胞的生長密度和細胞表達產(chǎn)物的生產(chǎn)效率產(chǎn)生負面影響[11]。基于此，本研究以表達人重組尿激酶原CHO工程細胞系11G-S為研究對象，試圖運用基因芯片技術(shù)揭示CHO工程細胞在批次培養(yǎng)及流加培養(yǎng)不同生長階段參與細胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達譜及調(diào)控細胞增殖相關(guān)信號通路的關(guān)鍵基因的表達狀態(tài)，為探尋進一步提高細胞生長密度和細胞表達產(chǎn)物生產(chǎn)效率的可能途徑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

表達人重組尿激酶原 CHO工程細胞系 11G-S (由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所構(gòu)建、保藏)。

1.1.2 培養(yǎng)基

CHO工程細胞批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)所用無血清培養(yǎng)基為添加了胰島素、腐胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白、微量元素、Pluronic F-68及硫酸葡聚糖等成分的DMEM/F12 (1∶1，V/V)[12]。流加培養(yǎng)基為由葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、微量元素、維生素、無血清添加成分、無機鹽及次黃嘌呤等組成的混合液。

1.1.3 基因芯片

CHO工程細胞基因表達水平分析采用安捷倫公司 (Aglient Technologies) 的小鼠全基因組表達譜芯片小鼠全基因組芯片 (Whole mouse genome microarray kit)，其性能參數(shù)見表1。

1.1.4 基因芯片分析樣品

選取細胞接種時、無血清懸浮批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)的不同生長階段的 CHO工程細胞用作基因分析樣品，樣品的選取和說明見表2。

表1 Aglient小鼠全基因組表達譜芯片Table 1 Specifications of Aglient whole mouse genome microarray kit

表2 用于基因芯片分析的樣品Table 2 Samples for comparative transcriptional analysis by gene chip

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

CHO工程細胞以3×105cells/mL接種于100 mL三角瓶內(nèi)，培養(yǎng)體積 35 mL，培養(yǎng)時加入含有5 mmol/L谷氨酰胺、0.1% (W/V) Pluronic F-68及25 μg/mL硫酸葡聚糖的無血清培養(yǎng)基，37 ℃、90 r/min懸浮培養(yǎng)。流加培養(yǎng)于接種后72 h，每24 h加入3 mL流加培養(yǎng)基。

1.2.2 細胞周期的檢測

分別于CHO工程細胞批次培養(yǎng)24、72、120、168 h和流加培養(yǎng)72、120、168、216 h各取細胞約1×106個，用75%的冰乙醇固定1 h，?20 ℃保存。流式細胞儀分析前先用PBS洗滌細胞，加入0.2 mL RNase A，37 ℃水浴消化30 min，再加入0.3 mL碘化丙啶 (Propidium iodide，PI) 置暗處染色20 min，用流式細胞儀 (BD FACSCalibur，USA) 檢測細胞周期。

1.2.3 樣品RNA抽提、基因芯片雜交及分析

取約1×107個細胞加入1.5 mL EP管中，采用Trizol 試劑盒提取RNA。采用苯酚/氯仿層相分離法純化總RNA，將提取的RNA保存于?70 ℃超低溫冷柜保存。用Nanodrop分光光度計測定RNA在260、280及230 nm的吸收值，以計算濃度并評估純度。同時，用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的純度及完整性。

用cy3熒光標記RNA樣品，然后利用等量的探針進行雜交，雜交條件為42 ℃、16 h，55 ℃洗片。采用Agilent掃描儀對芯片進行掃描，讀取數(shù)據(jù)，分辨率為5 μm、光電耦合裝置 (Photoelectric multiplication tube，PMT) 電壓100%，采用Gene spring軟件進行標定處理分析，并將樣品與對照比值取以2為底的對數(shù)，所得數(shù)值大于或等于1作為基因上調(diào)的篩選標準，所得數(shù)值小于或等于?1作為基因下調(diào)的篩選標準。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)測得的基因數(shù)據(jù)，首先將標準化的目標基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入Genemapp軟件中，并設(shè)定標準以界定上調(diào)或下調(diào)基因差異表達的程度，運用已知有關(guān)小鼠細胞周期及信號通路圖，找出顯著差異表達的基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 CHO 工程細胞批次和流加培養(yǎng)時的生長周期分布

圖1所示為CHO工程細胞無血清批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)過程中的活細胞密度變化。培養(yǎng)的前 3天，無血清批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)的 CHO工程細胞處于相同的培養(yǎng)條件，細胞處于對數(shù)生長期，活細胞密度呈現(xiàn)相同快速增加態(tài)勢。批次培養(yǎng)CHO工程細胞于第4天達到41.5×105cells/mL的最大活細胞密度，隨后活細胞密度呈現(xiàn)下降趨勢，培養(yǎng)10 d后的活細胞密度減低至18.4×105cells/mL；流加培養(yǎng)CHO工程細胞的快速生長期持續(xù)至第5天，于第6天達到78.1×105cells/mL的最大活細胞密度，隨后活細胞密度呈現(xiàn)下降趨勢，培養(yǎng)10 d后的活細胞密度減低至50.4×105cells/mL (圖1)。

圖1 CHO工程細胞在批次和流加培養(yǎng)過程中的活細胞密度變化Fig. 1 Profile of viable cell density of the CHO cells in both batch and fed-batch cultures.

依照 CHO工程細胞無血清批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)過程中的活細胞密度變化，選取批次培養(yǎng) 24、72、120和168 h分別代表CHO工程細胞批次培養(yǎng)的對數(shù)生長早期、對數(shù)生長晚期、平臺期和衰退期；選取流加培養(yǎng)72、120、168和216 h分別代表CHO工程細胞流加培養(yǎng)的對數(shù)生長中期、對數(shù)生長晚期、平臺期和衰退期。批次培養(yǎng)的CHO工程細胞隨培養(yǎng)時間延長，G1期所占細胞比例明顯升高(圖2A)；流加培養(yǎng)的 CHO工程細胞處于G2期的細胞比例隨培養(yǎng)時間延長明顯升高 (圖2B)。批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)的CHO工程細胞中，處于S期的細胞比例均隨培養(yǎng)進程呈現(xiàn)逐步下降的趨勢 (圖2A，B)。CHO工程細胞無血清批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)過程中的細胞周期分布變化與其各自的活細胞密度變化基本一致。

2.2 CHO工程細胞樣品的RNA的質(zhì)量鑒定

圖3為各CHO工程細胞樣品經(jīng)RNA抽提處理后的變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，各泳道均可見明亮的28S和18S核糖體RNA區(qū)帶以及稍顯暗淡和彌散tRNA和5S核糖體RNA區(qū)帶，表明各細胞樣品RNA抽提成功。表3為各提取RNA樣品的紫外分光光度計檢測結(jié)果，OD260/OD280比值介于1.8到2.0之間，OD260/OD280比值大于1.8，表明提取的總RNA樣品質(zhì)量完好。

圖2 CHO工程細胞批次培養(yǎng) (A) 和流加培養(yǎng) (B) 過程中不同生長階段的細胞周期分析Fig. 2 Cell cycle analysis of the CHO cells in different growth phase in both batch (A) and fed-batch (B) cultures.

圖3 總RNA樣品的變性瓊脂糖凝膠電泳Fig. 3 Total RNA analysis of the CHO cells by denatured agarose electrophoresis. 1?6: total RNA of sample 1 to 6 respectively.

2.3 基因芯片實驗數(shù)據(jù)分析

基因芯片實驗數(shù)據(jù)來自于 CHO工程細胞批次培養(yǎng)及流加培養(yǎng)對數(shù)生長期、平臺期及衰退期 3個階段的樣品，以培養(yǎng)起始接種的細胞作為對照，其他樣品的每個基因標準化值與之相比，所得數(shù)值取以2為底的對數(shù)。圖4A、B分別為CHO工程細胞在兩種培養(yǎng)模式下比值大于1或小于?1及大于2或小于?2的基因上調(diào)及下調(diào)表達的差異狀況。在基因芯片分析涉及的19 191個目標基因中，有差異表達的基因較多。總體而言，下調(diào)表達的基因數(shù)量多于上調(diào)表達基因數(shù)目，且上調(diào)表達基因其比值大多介于1和2之間，下調(diào)表達基因其比值大多介于?2和?1之間。在細胞生長的對數(shù)期及平臺期，上調(diào)及下調(diào)表達的基因數(shù)目雖有差異，但總體上處于相對平衡的狀態(tài)，說明細胞在較好的培養(yǎng)環(huán)境中，其細胞正負調(diào)控基因的表達相對平衡；在細胞生長的衰退期，下調(diào)表達的基因數(shù)目明顯多于上調(diào)表達的數(shù)目，特別是顯著下調(diào)表達的基因所占的比例顯著升高，說明隨著培養(yǎng)環(huán)境的惡化，細胞更多是以下調(diào)表達基因的方式，來適應(yīng)不斷變化的培養(yǎng)環(huán)境及維持自身的活力。對比兩種培養(yǎng)模式的差異表達基因的方式及數(shù)量也有著明顯的差異，特別是在流加培養(yǎng)的衰退期，下調(diào)表達的基因數(shù)量明顯多于批次培養(yǎng)的衰退期，提示在流加培養(yǎng)模式下，隨著培養(yǎng)體系中營養(yǎng)物、有毒代謝廢物累積及滲透壓的提高，細胞對環(huán)境的應(yīng)激調(diào)控強度遠遠高于細胞在批次培養(yǎng)模式下由于少數(shù)營養(yǎng)物缺乏所產(chǎn)生的應(yīng)激調(diào)控。

表3 用紫外吸光法測定RNA濃度和純度Table 3 Concentration and purity of the total RNA from the CHO cells determined by ultroviolet absorption

圖4 細胞無血清批培養(yǎng)及流加培養(yǎng)的基因表達差異Fig. 4 Number of differentially regulated genes of both batch and fed-batch cultures at different cell growth phases using two different significance criteria: fold change≥1 (A) or 2 (B) at P-value≤0.05. a: logarithm growth phase; b: plateau phase; c: recession phase of the cells.

2.4 兩種培養(yǎng)模式下與細胞周期相關(guān)基因表達的差異

CHO工程細胞在批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)過程中，細胞周期調(diào)控基因雖然呈現(xiàn)基本相同的以下調(diào)表達為主的轉(zhuǎn)錄譜，但流加培養(yǎng)過程中參與細胞周期調(diào)控的上調(diào)表達基因僅為 Smad4，明顯少于批次培養(yǎng)CHO工程細胞中的上調(diào)基因 (圖5)。

在涉及細胞周期的86個主要基因中，批次培養(yǎng)對數(shù)期生長期細胞的差異表達基因包括，G1期上調(diào)表達的 Hdac7a基因及下調(diào)表達的 Tfdp1、Ccne2、Hdac5、E2f5基因；S期上調(diào)表達的Orc1l及下調(diào)表達的 Orc5l基因。細胞生長進入平臺期時，有差異表達的基因明顯增多，主要有 G1期上調(diào)表達的Gsk3b、Ccnd2、Tfjp1、Hdac7a基因及下調(diào)表達的Ccne1、Ccne2、Cdk6、Hdac5、E2f5基因；S期上調(diào)表達Trp53、Orc1l、Orc2l、Mcm2基因及下調(diào)表達的 Orc5l、Ywhag、Cdc45l、Pcna，M 期的基因Espl1。當細胞生長進入衰退期后，上調(diào)表達的基因明顯減少，上調(diào)表達的基因主要有 G1期的 Smad4及Hdac7a基因；下調(diào)表達因與平臺期相比沒有太大的差異，下調(diào)表達的基因主要包括 G1期的基因Ccne1、Ccne2、Cdk2、Hdac5及E2f5；S期的Ywhag、Pcna、Cdk2、Cdc45l、Orc4l及Orc5l基因；G2期的Cdc2a基因和M期的Espl1基因。Hdac7a基因在CHO細胞批次培養(yǎng)的各階段均上調(diào)表達，Ccne2、Orc5l、Hdac5及E2f5在批次培養(yǎng)的各階段均下調(diào)表達，Ywhag、Pcna、Ccne1、Cdc45l及Espl1在批次培養(yǎng)的平臺期及衰退期均下調(diào)表達。

細胞在流加培養(yǎng)模式下的流加培養(yǎng)階段差異表達的基因以下調(diào)表達為主，且與批次培養(yǎng)模式下細胞的平臺期及衰退期差異表達的基因大體相近，上調(diào)表達的基因僅有Smad4基因。在流加培養(yǎng)的平臺期，下調(diào)表達的基因主要有G1期的Ccne1及E2f1，S期的Ywhag，G2期Cdc2a及Plk1，M期的Espl1；當細胞生長進入衰退期后，差異表達的基因明顯增加，并且基本上都為下調(diào)表達，僅有 G1期的基因Smad4上調(diào)表達。下調(diào)表達的基因包括G1期的基因Ccne1、Ccne2、Hdac5、Tfdp1、Hdac7a及E2f1，S期的基因Ywhag、Ccnh、Orc5l、Cdc45l及Cdc7，G2期的基因Mad2l1、Cdc2a及Plk1，M期的基因Espl1。

3 討論

細胞周期進程的實現(xiàn)有賴于各級調(diào)控因子對細胞周期精確而嚴密的調(diào)控。這些調(diào)控因子的核心是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 (Cyclin dependent kinases，CDKs) 及其正、負性調(diào)控因子——細胞周期蛋白 (Cyclin) 和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑 (CDI)[13-14]。CDKs屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，可在特定的細胞周期被激活，之后磷酸化相應(yīng)的底物，從而引起后續(xù)事件的發(fā)生。Cyclin作為蛋白激酶復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞基，對 CDKS起著正性調(diào)節(jié)作用。在高等真核細胞中，Cyclin 分為A、B、C、D、E和H六類。它們分別在細胞周期的不同時相中合成、積累，并與相應(yīng)的CDKs結(jié)合，激活CDKs的蛋白激酶活，從而調(diào)節(jié)細胞周期進程。同時 CDKs的活性也可以被細胞周期抑制蛋白(Cell cycle inhibitory proteins，CKIs) 所抑制。

從依照細胞周期調(diào)控的信號通路圖分析，批次培養(yǎng)對數(shù)期生長期的CHO工程細胞，僅Cyclin E2發(fā)生了下調(diào)表達，其他基因表達均沒有明顯差異。隨著細胞生長進入平臺期及衰退期，CDKs、Cyclin家族中的相應(yīng)基因的數(shù)目在細胞的G1、S及G2期下調(diào)表達明顯增加，主要有基因 Cdk6、Cdk2、Cdc2a、Ccne1及Ccne2，且細胞在衰退期下調(diào)表達基因多于平臺期。同時TGF2β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心分子Smad4在批次培養(yǎng)CHO工程細胞的衰退期上調(diào)表達。研究表明，Smad4的失活是引起細胞生長抑制喪失的一個重要原因[15]。批次培養(yǎng)CHO工程細胞在衰退期通過上調(diào)表達Smad4進一步抑制了細胞的生長。反映在細胞周期分布上，CHO工程細胞在對數(shù)期 G1期細胞所占的比例較低，S期細胞所占的比例較高，細胞可以快速增殖；在進入培養(yǎng)的平臺期及衰退期后，G1期細胞所占的比例不斷升高，S期細胞所占的比例卻逐漸降低，大多數(shù)細胞停滯于G1期，細胞生長緩慢或停止。

圖5 批次和流加培養(yǎng)中細胞的細胞周期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄譜Fig. 5 Transcriptional profiling of cell cycle regulatory networks of cells in batch and fed-batch cultures.

流加培養(yǎng) CHO工程細胞在細胞生長的平臺期及衰退期，CDKs、Cyclin及CKI家族中的相應(yīng)基因在G1、S及G2期下調(diào)表達基因的數(shù)量逐漸增加，且衰退期下調(diào)表達的基因多于平臺期。與批次培養(yǎng)平臺期及衰退期 CHO工程細胞下調(diào)表達的基因數(shù)目相比，流加培養(yǎng)相應(yīng)階段CHO工程細胞下調(diào)表達的基因少于批次培養(yǎng)。同時Smad4在培養(yǎng)衰退期也發(fā)生了上調(diào)表達，且強度高于批次培養(yǎng)。表明由于導(dǎo)致 CHO工程細胞在批次培養(yǎng)及流加培養(yǎng)模式下增殖減緩的原因不同，因此在細胞周期調(diào)控基因的表達也有所差異。反映在細胞周期分布上，CHO工程細胞在流加培養(yǎng)過程中，G1期細胞所占的比例呈現(xiàn)出先降后升的變化趨勢，S期細胞所占的比例呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢。

本研究獲得的批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng) CHO工程細胞的細胞周期調(diào)控基因表達譜提示，CHO工程細胞在批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)過程中，主要是通過下調(diào)表達CDKs、Cyclin及CKI家族中的Cdk6、Cdk2、Cdc2a、Ccne1、Ccne2基因及上調(diào)表達Smad4基因，實現(xiàn)細胞增殖的調(diào)控。

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