李巖強，王春連，趙開軍

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)部作物遺傳育種重點實驗室 農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程，北京 100081

黃單胞桿菌屬 (Xanthomonas) 的多個致病變種，在多種作物上造成嚴重的病害，包括辣椒和番茄的細菌性斑點病、水稻的白葉枯病和細菌性條斑病[1]。TAL 效應(yīng)子 (Transcription activator Like effector) 作為黃單胞桿菌的蛋白類效應(yīng)子之一，能夠通過三型分泌系統(tǒng) (Type III secretion system，TTSS) 進入植物的細胞核，并與特定基因啟動子DNA結(jié)合，類似于真核生物轉(zhuǎn)錄因子，啟動植物基因的表達，以控制植物的生理生化進程。病原菌通過進化產(chǎn)生一系列的TAL效應(yīng)子以利于在寄主上的定殖和傳播，而植物亦進化出一系列的抗病策略以抑制該病原菌引起的病害。因此針對不同的寄主植物的基因型，TAL效應(yīng)子既有可能是毒性因子，也有可能是無毒因子。近年來關(guān)于黃單胞桿菌的蛋白類效應(yīng)子TAL效應(yīng)子的研究有許多新進展，尤其是TAL效應(yīng)子與寄主 DNA特異性識別的分子密碼的破解，將在生物工程領(lǐng)域和植物抗病育種應(yīng)用上產(chǎn)生重要的影響。本文在介紹TAL效應(yīng)子類蛋白的發(fā)現(xiàn)及功能、TAL效應(yīng)子與寄主靶基因識別的專一性及其分子密碼的基礎(chǔ)上，討論了該分子密碼的應(yīng)用前景。

1 TAL效應(yīng)子的發(fā)現(xiàn)及研究現(xiàn)狀

1.1 TAL效應(yīng)子的發(fā)現(xiàn)及功能

第一個TAL效應(yīng)子 (AvrBs3) 于1989年發(fā)現(xiàn)于辣椒斑點病細菌 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (xcv) 中，其編碼基因avrBs3的中心區(qū)有17.5個幾乎相同的102 bp堿基重復(fù)，每個重復(fù)編碼34個氨基酸，全基因共編碼一個1 164 aa的蛋白質(zhì)(122 kDa)[2]。此后發(fā)現(xiàn)的TAL效應(yīng)子類蛋白被稱為AvrBs3家族蛋白。TAL效應(yīng)子類家族蛋白具有結(jié)構(gòu)的相似性 (圖1A，B)：1) N端高度保守，其mRNA水平上存在著TTSS分泌信號 (T3S)；2) C端含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu) (Leucine zipper，LZ)、核定位信號(Nuclear localization signals，NLSs) 和酸性轉(zhuǎn)錄激活域 (Acidic activation domain，AD)；3) 中間為多個串聯(lián)重復(fù)單元組成的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，每個重復(fù)單元含有34個氨基酸，其中第12和13位氨基酸高度可變，被稱為重復(fù)可變區(qū) (Repeat-variable diresidue，RVD)[3]。研究表明NLS具有核定位功能，而保守的LZ和 AD結(jié)構(gòu)都是引起過敏反應(yīng) (Hypersensitive reaction，HR) 所必需的。所有的 TAL效應(yīng)子都具有相同的NLS及AD，只是其重復(fù)可變區(qū)的重復(fù)數(shù)目和重復(fù)類型不同，并決定TAL效應(yīng)子與寄主識別的特異性。

TAL效應(yīng)子對于寄主植物，既是無毒因子，又是毒性因子。從最早克隆的avrBs3基因到最近克隆的avrXa7、avrXa10、AvrXa27，分別能使含相應(yīng)抗病基因的寄主引起 HR反應(yīng)，從而引起寄主的抗病反應(yīng)，表現(xiàn)出無毒效應(yīng)子功能。而對于不含相應(yīng)抗病基因的寄主，這些無毒蛋白就表現(xiàn)為毒性因子，能夠引起寄主植物發(fā)病。

1.2 已經(jīng)克隆的TAL效應(yīng)子編碼基因及其寄主靶基因

TAL效應(yīng)子類蛋白廣泛存在于黃單胞桿菌屬Xanthomonas和少數(shù)的青枯拉爾氏菌屬 Ralstonia solanacearum中[4]。水稻黃單胞桿菌白葉枯病致病變種 (Xanthomonas oryzae pv. oryzae) 引起的水稻白葉枯病 (Bacterial blight，BB) 是一種典型的“基因?qū)颉辈『?，植物病原細菌的無毒基因 (Avirulence gene，avr) 和寄主植物抗病基因 (Resistance gene，R) 的顯性互作決定不親和反應(yīng)[5]。李平等 2004年對黃單胞菌無毒基因的研究進展作了綜述[6]。李玉蓉等于2007年對水稻黃單胞桿菌白葉枯病無毒新基因的克隆以及細菌性條斑病 (Bacterial leaf streak，BLS) 的病原菌 (Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)無毒基因的研究進展進行了綜述[7]。但隨著黃單胞桿菌屬許多生理小種的測序[8-12]與進一步研究，該領(lǐng)域的進展日新月異。目前，已有更多的TAL效應(yīng)子編碼基因及其寄主靶基因被克隆。例如，我們通過構(gòu)建PXO99的Tn5轉(zhuǎn)座子插入的突變體庫，篩選使近等基因系 CBB23致病的菌株[13]，并克隆了水稻 Xa23基因?qū)?yīng)的無毒基因 avrXa23，發(fā)現(xiàn)AvrXa23蛋白是一個TAL效應(yīng)子，它被Xa23基因的啟動子陷阱捕獲而激發(fā)水稻產(chǎn)生強烈的抗病反應(yīng)。White等于2009年將已鑒定的TAL效應(yīng)子及其寄主靶基因的信息進行了列表綜述[14]，由于該領(lǐng)域進展很快，筆者在 White文章基礎(chǔ)上將國內(nèi)外已克隆鑒定的黃單胞菌TAL效應(yīng)子及其相關(guān)信息的最新進展整理成表1。

圖1 以AvrBs3為例說明TAL效應(yīng)子的結(jié)構(gòu)和功能Fig. 1 Structure and function of the TAL effector AvrBs3. (A) The TAL effector AvrBs3 contains central tandem repeats (Repeat domain), the type III signal at N-terminal in mRNA level; the nuclear localization signals (NLSs) and an acidic transcriptional activation domain (AD) at C-terminal. (B) The amino acid sequences of the repeat domain of AvrBs3. The amino acids 12 and 13 are hypervariable, the repeats are numbered in the right and the left is the corresponding nucleotide. Because the all known UPT box has an invariable 5' T, so the 0-position is the nucleotide T. (C) Using the nuclear localization signals, the TAL effectors translocate into the plant cell through type III secretion system, bind the UPT Box of target genes: the R genes or S genes, respectively result in the resistance such as HR response and disease symptom like hypertrophy.

絕大多數(shù)的TAL效應(yīng)子對應(yīng)的寄主靶基因仍然未知，研究最清楚的avrBs3，其寄主靶基因為Bs3、UPA20等；AvrBs3被注入到植物的細胞核中，其中抗病基因 Bs3啟動子區(qū)存在能夠特異性識別該無毒基因的元件，受其誘導(dǎo)表達，產(chǎn)生抗性[15]。感病品種中受AvrBs3誘導(dǎo)的UPA20等是感病相關(guān)的基因，UPA20是一個轉(zhuǎn)錄因子，能夠誘導(dǎo)下游基因 UPA7的表達，進而引起寄主細胞肥大，有利于病原菌的侵染和定殖[16]。AvrBs4的寄主靶基因是Bs4，與其他TAL效應(yīng)子不同的是，AvrBs4是在植物細胞質(zhì)而不是細胞核中與Bs4識別并產(chǎn)生抗病的[17]。其他研究比較明確的主要為水稻白葉枯病細菌的 TAL效應(yīng)子及其對應(yīng)的寄主靶基因，如 avrXa3/Xa3、avrXa5/Xa5、avrXa7/Xa7和Os11N3、avrXa10/Xa10、

avrXa23/Xa23、avrXa27/Xa27、pthXo1/Os8N3、pthXo3/Os11N3、pthXo6/OsTFX1、Tal9a/OsHEN1等(表1)?？拱兹~枯病基因Xa27能夠?qū)Ｒ恍缘厥芎瑹o毒蛋白 avrXa27菌的誘導(dǎo)，引起植物的抗病，而其等位基因xa27由于啟動子區(qū)的缺失和突變，不能受avrXa27的誘導(dǎo)，進而發(fā)生感病[18]。PthXo1是一個毒性因子，它能夠誘導(dǎo)水稻中感病基因Os8N3的表達，引起植物感病，對該感病基因進行沉默可以使水稻對含PthXo1的菌株產(chǎn)生抗性，Os8N3是MtN3家族中的一員，對水稻的花粉發(fā)育有促進作用，但是Os8N3的生化功能還未知[19]。而隱性抗白葉枯病基因xa13是Os8N3基因啟動子區(qū)發(fā)生了變化而不能夠受PthXo1的誘導(dǎo)表達[20]。目前鑒定的TAL效應(yīng)子類蛋白絕大多數(shù)為毒性因子，少數(shù)的為無毒因子，而目前發(fā)現(xiàn)的大部分寄主靶基因為抗病基因，也有少數(shù)的為感病基因如：Os11N3、Os8N3、OsTFX1及OsHEN1等。當(dāng)前研究比較清楚的TAL效應(yīng)子都與靶基因啟動子識別進而引起抗病或感病反應(yīng)，而仍然有許多 TAL效應(yīng)子與靶基因的作用機制仍不明朗，需要進一步的研究證實。

表1 已鑒定的TAL效應(yīng)子Table 1 List of identified TAL effectors

2 TAL效應(yīng)子與寄主靶基因識別的專一性

含有AvrBs3蛋白的黃單胞桿菌能夠引起含Bs3基因的辣椒品種ECW-30R的抗病反應(yīng)，即產(chǎn)生HR (圖1C)，對avrBs3的重復(fù)區(qū)進行缺失突變后，發(fā)現(xiàn)缺失突變體avrBs3?rep不能引起ECW-30R產(chǎn)生抗病反應(yīng)[2]。但其中的一些突變體如avrBs3?rep16 (缺失 11~14之間的重復(fù)) 能夠引起另一個辣椒品種ECW產(chǎn)生HR反應(yīng)。后來的研究發(fā)現(xiàn)AvrBs3?rep16能夠特異性識別Bs3等位基因Bs3-E的啟動子[15]。AvrXa7和AvrXa10分別含有25.5和15.5個重復(fù)單元，若它們的重復(fù)區(qū)互置，所識別的抗病基因 Xa7和 Xa10也發(fā)生相應(yīng)的變化，即含有 AvrXa10重復(fù)區(qū)的AvrXa7可以識別Xa10，含有AvrXa7重復(fù)區(qū)的AvrXa10可以識別 Xa7[21]。水稻抗白葉枯病基因Xa27專一性地受白葉枯病原菌中無毒蛋白AvrXa27的誘導(dǎo)表達[18]，感病基因Os8N3 (Xa13) 受TAL效應(yīng)子PthXo1的誘導(dǎo)[19]，而當(dāng)Os8N3啟動子區(qū)發(fā)生突變，可以逃避 PthXo1的識別，xa13抗病基因便因此獲得對白葉枯病的抗性[20]。

深入的研究發(fā)現(xiàn)，TAL效應(yīng)子與寄主靶基因的特異性識別發(fā)生在啟動子區(qū)域。AvrBs3和AvrBs3?rep16分別特異地與Bs3及Bs3-E的啟動子區(qū)的特定序列互作[22-23]，R?mer等將這些識別序列稱為UPT((UP regulated by TAL effectors)Box。缺失突變分析和體外的 EMSA實驗表明：AvrBs3和AvrBs3?rep16分別與UPTAvrBs3box和UPTAvrBs3?rep16box專一性識別[22]。水稻抗白葉枯病基因Xa27受無毒蛋白AvrXa27的誘導(dǎo)表達，序列分析發(fā)現(xiàn)，Xa27與其等位基因xa27的編碼區(qū)沒有明顯的差異，只是在啟動子區(qū)存在堿基的缺失和變異[18]。對Xa27的啟動子進行分析，并將靠近TATA box區(qū)的突變位點的相關(guān)片段導(dǎo)入到 xa27的啟動子中，發(fā)現(xiàn)融合后的xa27啟動子能夠受 AvrXa27的誘導(dǎo)，利用缺失突變及 EMSA實驗最終確定了最短的 UPTavrXa27box序列[23]。TAL效應(yīng)子不僅能夠識別抗病基因的啟動子，它們的靶基因還可能是感病相關(guān)的基因。受AvrBs3誘導(dǎo)的Upa20基因能夠引起植物生理狀態(tài)上的變化，例如細胞分裂以及細胞增大，以利于病原菌在寄主中的定殖和生長 (圖2C)[16]。受無毒因子誘導(dǎo)的另外一些典型的感病基因如 Os8N3 (Xa13)、OsTFX1以及Os11N3等分別受PthXo1、PthXo6及AvrXa7的特異性誘導(dǎo)[19,24-26]。同樣地，利用缺失突變及 EMSA實驗分析的方法，相應(yīng)的 UPT Box：UPTPthXo1Box、UPTPthXo6Box以及UPTAvrXa7Box得到確認，根據(jù)UPT box單個堿基的突變分析表明，特定的TAL效應(yīng)子，專一性誘導(dǎo)特定的UPT Box[27]。上述實驗表明，特定的TAL效應(yīng)子識別相應(yīng)的UPT box，這也是為什么許多R基因 (Bs3、Xa27、Xa7、Xa10) 僅受特定的AvrBs3類無毒蛋白誘導(dǎo)的原因，這從分子水平上驗證了“基因?qū)颉睂W(xué)說。

3 TAL效應(yīng)子與寄主靶基因識別的分子密碼

AvrBs3直接識別被其誘導(dǎo)的靶基因啟動子區(qū)的UPT Box[22,28]，引起受AvrBs3誘導(dǎo)的許多基因如UPA1-11[29]、UPA14-25[30]的表達，導(dǎo)致感病植株的葉肉細胞肥大 (圖 1C)。Kay等分析受 AvrBs3誘導(dǎo)的基因Bs3、UPA10、UPA12、UPA14、UPA19、UPA20、UPA21、UPA23及UPA25啟動子轉(zhuǎn)錄起始點上游100 bp序列，發(fā)現(xiàn)這些受AvrBs3誘導(dǎo)的基因含有相同的UPA motif基序，有19個核苷酸組成的box具有極強的保守性，與以前鑒定的AvrBs3的UPT Box一致[30]。由于UPT Box[18 bp[29]和19 bp[30]]的堿基數(shù)與 AvrBs3的重復(fù)數(shù) (17.5) 基本一致，Boch等推測 AvrBs3的每一個重復(fù)單元識別一個特異的DNA堿基對[31]。當(dāng)每一個AvrBs3的重復(fù)類型(每個重復(fù)區(qū)的第 12和第 13氨基酸) 對應(yīng)到 UPT Box中去時，發(fā)現(xiàn)特定的重復(fù)類型與目標DNA上的特異堿基相關(guān)聯(lián) (圖1B)。例如HD和NI分別對C和A有很強的偏愛，而AvrBs3?rep16 (缺失11~14之間的重復(fù))，能夠識別更短的或者 (DNA Box的3′端)不同的目標DNA序列[31]。另外，在UPT Box的5′末端，對應(yīng)于第一個預(yù)測的重復(fù)堿基的前一個位點上含有一個保守的 T[31]。后來的研究發(fā)現(xiàn)保守的 T堿基對于誘導(dǎo)活性至關(guān)重要[27]。Boch等通過分析多個無毒蛋白重復(fù)類型以及受其誘導(dǎo)的基因啟動子區(qū)的UPT Box的對應(yīng)關(guān)系，構(gòu)建了不同重復(fù)類型特異性識別目標DNA堿基的分子密碼模型[31]。與此同時，Moscou和 Bogdanove利用計算機掃描比對TAL效應(yīng)子中可變重復(fù)類型與目標啟動子中的DNA序列，統(tǒng)計分析得到了類似的分子密碼模型(圖1B)[32]。

為了驗證病原菌無毒蛋白與靶基因 DNA特異性識別的分子密碼模型，Boch等分析受AvrXa27、PthXo1、PthXo6及 PthXo7誘導(dǎo)的基因及其等位基因的啟動子區(qū)，發(fā)現(xiàn)受誘導(dǎo)的基因中均含有相匹配的UPT Box，而不受誘導(dǎo)的等位基因找不到相應(yīng)的UPT Box[31]。他們將預(yù)測的 UPT Box構(gòu)建到最小Bs4(–55~+25) 啟動子的上游，驅(qū)動 GUS基因，與含有相對應(yīng)35S啟動子驅(qū)動的TAL效應(yīng)子載體的農(nóng)桿菌共注射本茗煙，證明預(yù)測的UPT Box受相應(yīng)的TAL效應(yīng)子誘導(dǎo)。他們還根據(jù)已知的密碼模型，成功預(yù)測了Hax2的靶基因PAP1(At1G56650)。此外，Boch等構(gòu)建了7個人造的TAL效應(yīng)子 (ArtX)，將它們構(gòu)建成N端融合了GFP報告基因的人造效應(yīng)子，并檢驗其誘導(dǎo)含有預(yù)測的UPT box的Bs4啟動子驅(qū)動報告基因表達的能力。這 7個人造效應(yīng)子都只激發(fā)含相應(yīng)的UPT Box的啟動子引起GUS表達活性，且人造的ArtX和GFP融合蛋白能夠在植物細胞中表達[31]。

4 TAL效應(yīng)子與寄主靶基因識別密碼的應(yīng)用前景

4.1 TALN的產(chǎn)生及應(yīng)用前景

TAL效應(yīng)子與寄主靶基因的互作是一種新型的蛋白-DNA結(jié)合方式，即2個特異的氨基酸組合對應(yīng)1個特異的堿基。根據(jù)TAL效應(yīng)子與寄主靶基因相互識別的分子密碼，科學(xué)家已將TAL效應(yīng)子與核酸內(nèi)切酶 FokⅠ融合構(gòu)建了新型的位點特異性識別的工具酶TALNs (TAL effector nucleases)，并通過體外實驗，對識別的特異性進行了驗證[33-34]。Li等構(gòu)建了AvrXa7和PthXo1與核酸內(nèi)切酶FokⅠ融合的酶，通過體外的 DNA酶切實驗以及酵母內(nèi)的重組實驗均證明，TALN能夠特異性地識別其目標DNA序列，并使 FokⅠ在特定的位點進行酶切[33]。Christian等先是利用AvrBs3及PthXo1和核酸內(nèi)切酶FokⅠ融合的酶，發(fā)現(xiàn)了不同的融合酶對于酶切位點的活性受識別位點的距離的影響，他們還證明使用 2個不同的融合酶能夠分別識別特異的位點并共同完成酶切。同時，為了驗證該分子密碼，他們找到了基因組上的序列，并按照頻率最大的密碼 (NI對應(yīng)A， HD對應(yīng)C，NN對應(yīng)G以及NG對應(yīng)T) 人工設(shè)計了相對應(yīng)的TAL效應(yīng)子，通過酵母內(nèi)的實驗發(fā)現(xiàn)許多人工設(shè)計的融合酶具有很強的活性 (圖2A)[34]。

這些實驗證明了利用分子密碼設(shè)計相應(yīng)的TALN完成真核生物基因組的重組和突變成為可能。例如可以設(shè)計能與特定 DNA序列結(jié)合的人造效應(yīng)子，以完成靶基因的定點突變和重組。另外，這種轉(zhuǎn)錄因子模式可以控制目的基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達，如利用特異識別啟動子的人造TAL效應(yīng)子作為基因表達的分子開關(guān)，在轉(zhuǎn)錄水平上進行基因的表達調(diào)控。當(dāng)然，這種機制不僅僅用于植物，也可能應(yīng)用于人類重要疾病比如癌癥等的基因治療。我們預(yù)計，TALN將在未來的基因治療中受到重視并發(fā)揮重要作用。

4.2 利用分子密碼發(fā)掘更多的抗病基因和感病基因

根據(jù)分子識別密碼，可以利用TAL效應(yīng)子的可變區(qū)序列預(yù)測并尋找抗病基因或感病基因 (圖2B)。比如水稻基因組序列已經(jīng)完成，可以利用TAL效應(yīng)子可變區(qū)序列，掃描基因組序列，找到受其誘導(dǎo)的啟動子，進而研究相應(yīng)基因的功能。這可能為尋找抗病基因開辟一條新的途徑。如 Boch等根據(jù) TAL效應(yīng)子HAX2的序列，推測出其對應(yīng)啟動子的序列，并在擬南芥基因組中找到了靶基因 MYB轉(zhuǎn)錄因子類的PAP1 (At1G56650)[31]。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)多個毒性因子TAL效應(yīng)子，這樣可以根據(jù)其可變區(qū) (RVD) 的變化，推測出與感病相關(guān)的基因，研究植物感病的分子機制，并利用 RNAi的辦法抑制感病基因從而達到提高抗病性的目的。

圖2 TAL effector與靶基因識別的分子密碼的應(yīng)用前景Fig. 2 Applications and future prospects of molecular recognition code between TAL effectors and host genes. (A) Construction of hybrid TAL nucleases (TALN). This chimeric protein can bind the target nucleotides and cut at the relative position using the Fok I digestion function. This diagram takes the AvrXa7 and PthXo1 used in Li's paper[33] as an example. (B) Identify the resistance related genes. The known effectors can be used to identify their target genes through pattern search in the host plant's information resource. In this way, more and more resistance or susceptible genes can be identified in the future. (C) Create broader spectrum resistance gene. Multiple UPT-Boxes can be combined in one promoter to drive a R gene like Rxo1 or Xa27. This new engineered R gene complex can be recognized and induced by different TAL effectors, resulted in resistance to more pathogenic bacteriums.

4.3 利用分子密碼開發(fā)廣譜抗病基因啟動子

R?mer等利用基因工程的方法將不同的 UPT Box聚合到一個啟動子上，獲得受多個TAL效應(yīng)子誘導(dǎo)的新啟動子[27]。這種新型的啟動子使利用基因工程擴展抗病基因的抗譜成為可能。例如，在水稻白葉枯病抗病育種中，選育和種植抗病品種是防治該病的最經(jīng)濟、有效和環(huán)保的途徑。目前國內(nèi)外報道的白葉枯病抗病基因已經(jīng)有 36個之多[35]，但是由于水稻白葉枯病原菌致病性的變異和新毒性菌群的不斷出現(xiàn)，一些抗病品種的抗性逐漸喪失[36]。根據(jù)“基因?qū)颉崩碚摚共』蚴呛拖鄳?yīng)的無毒基因互作后起作用的，介導(dǎo)的抗性是小種特異性的，向植物中導(dǎo)人某一抗病基因后，它可以對攜帶特定無毒基因的病原菌產(chǎn)生抗性。目前克隆得到的抗白葉枯病基因的無毒基因很多，可以根據(jù)分子密碼設(shè)計受多種無毒基因誘導(dǎo)的UPT Box[27]。將新設(shè)計的含多個UPT Box的啟動子驅(qū)動一個抗病基因，使該抗病基因受多個無毒基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)，進而擴大抗病基因的抗譜 (圖2C)。另外，目前在細菌性條斑病細菌 (Xooc) 中也克隆到一些TAL效應(yīng)子類基因[37]。但是抗細菌性條斑病的主效基因報道仍然很少[38]，目前比較有效的為非寄主抗性基因Rxo1[39]，而組成型表達的抗白葉枯病基因 Xa27也可以抗一些細菌性條斑病小種[40]。可以利用TAL效應(yīng)子與寄主靶基因 DNA識別的分子密碼設(shè)計受多個細菌性條斑病細菌TAL效應(yīng)子誘導(dǎo)的啟動子，驅(qū)動抗病基因如Rxo1或Xa27，進而得到抗細菌性條斑病的抗病基因。目前我們擬利用已經(jīng)克隆得到的 avrXa23以及已經(jīng)發(fā)表的無毒基因，根據(jù)分子密碼推測的UPT Box組合成一個受多個TAL效應(yīng)子誘導(dǎo)的抗病基因啟動子，用于驅(qū)動抗病基因，期望能夠獲得更大的抗譜。

4.4 問題及展望

TAL效應(yīng)子與其靶基因互作的研究取得了很大進展，但是仍然有許多問題需要進一步揭示。例如TAL效應(yīng)子到底如何與 DNA堿基相結(jié)合，包括結(jié)合的方式及分子機制，以及為什么發(fā)生特異性的結(jié)合，這些都需要完成TAL效應(yīng)子及TAL-DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)解析才能準確地回答。TAL效應(yīng)子與寄主靶基因相互識別密碼的廣泛性還需要新的實驗證明。對于分子密碼的應(yīng)用研究也只是剛剛開始，TALN在基因組靶向修飾中的使用條件以及在各個物種中的通用性仍然需要進一步研究。受多種 TAL效應(yīng)子誘導(dǎo)的啟動子已經(jīng)構(gòu)建成功，但是構(gòu)建的新型啟動子能否獲得更大的抗譜仍然需要實踐證明。盡管如此，TAL效應(yīng)子與寄主靶基因識別的分子密碼作為一種新型的識別機制，具有很強的專一性，利用該分子密碼設(shè)計新的基因工程酶，尋找更多的抗病基因，構(gòu)建更多抗譜的抗病基因?qū)芯薮蟮膽?yīng)用前景。繼續(xù)研究黃單胞桿菌TAL效應(yīng)子與其對應(yīng)的寄主靶基因相互識別的分子機制，并將其相互識別的分子密碼應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程及農(nóng)業(yè)抗病育種技術(shù)中去，將為人類戰(zhàn)勝疾病及獲得更多的糧食提供更大的支持。

REFERENCES

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