陳家歡，魏育蕾，彭莎，王華巖

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100

目前，有關(guān)羊水干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的報(bào)道不多，而豬羊水干細(xì)胞 (Porcine amniotic fluid stem cell，pAFS) 向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究還未見有報(bào)道。同時(shí)，豬在生物物理和生物化學(xué)上與人有很多相似之處，因此體外誘導(dǎo) pAFS向心肌細(xì)胞分化，對臨床上進(jìn)行細(xì)胞治療與器官移植具有重要的意義。

羊水干細(xì)胞的分化能力介于胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞之間，具有向三胚層細(xì)胞分化的能力[1]，可以在一定條件下，誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞[1-3]、神經(jīng)細(xì)胞[1]等。羊水干細(xì)胞既可以從產(chǎn)前診斷的羊水中提取，也可以從產(chǎn)后的羊水中分離得到。由于抽取羊水的過程既不會(huì)像骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備那樣損傷供體，也避免了胚胎干細(xì)胞獲得過程中存在的相關(guān)倫理之爭[4]。因此羊水干細(xì)胞較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞具有更大的優(yōu)越性。

心血管疾病已成為威脅人類健康的一大殺手，而成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞再生能力極差，心肌細(xì)胞損傷壞死后由纖維組織替代，導(dǎo)致心臟的收縮舒張功能障礙，最終導(dǎo)致慢性心力衰竭的發(fā)生[5]。如何使心肌細(xì)胞在數(shù)量及功能上得到補(bǔ)償，是心血管疾病研究所面臨的一個(gè)難題。有研究報(bào)道，向受損心肌局部移植有功能的細(xì)胞，使其在心肌梗死區(qū)增殖分化為肌組織，可以增加有功能的肌細(xì)胞數(shù)量，改善心肌功能[6]。

目前，用于研究的替代細(xì)胞主要有：胎兒心肌細(xì)胞、成年心肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等[7-9]。但是這些替代細(xì)胞因來源不足 (如胎兒心肌細(xì)胞、成年心肌細(xì)胞)，對供體損傷性大 (如采集自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞) 和倫理學(xué)問題 (如來自早期發(fā)育的囊胚的胚胎干細(xì)胞) 而受到一定限制。因此尋找新的干細(xì)胞來源，已成為亟待解決的問題。本研究用不同濃度的 5-氮胞苷 (5-azacytidine，5-aza) 和 (或) 維生素C (Vitamin C，Vc) 誘導(dǎo)pAFS向心肌細(xì)胞分化，并通過免疫熒光染色、RT-PCR、透射電鏡等技術(shù)分析誘導(dǎo)得到了跳動(dòng)心肌細(xì)胞團(tuán)，旨在建立一個(gè)由pAFS向心肌細(xì)胞分化的有效方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

α-MEM、PBS、胎牛血清 (Fatal bovin serum，F(xiàn)BS)、谷氨酰胺 (Gibco公司)，胰蛋白酶、5-aza、Vc、青霉素、鏈霉素 (Sigma公司)，Trizol (Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶 (Fermentas公司)，一抗 anti-α-actin (Sigma公司)，一抗 anti-Tnni3 (Abcam公司)，綠色熒光標(biāo)記二抗Fitc與紅色熒光標(biāo)記二抗cy3 (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.2 pAFS的分離培養(yǎng)

從懷孕的八眉豬子宮采集樣本，帶回實(shí)驗(yàn)室后，在無菌環(huán)境下抽取豬羊水，置于無菌離心管中，1 500 r/min離心 10 min后去上清，用雙抗PBS (100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素) 重懸后再次離心，如此反復(fù) 2次后將細(xì)胞接種至 ACM培養(yǎng)液中(α-MEM+10% FBS+2 mmol/L谷氨酰胺+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素)。細(xì)胞在38 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)5~12 d后，可見有細(xì)胞貼壁，長到80%滿時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后每 2天傳代一次[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中主要采用P10至P15代的細(xì)胞。

1.3 類胚體 (Embryoid bodys，EBs) 的形成

將 pAFS細(xì)胞按 1×106/mL密度接種到直徑3.5 cm的非貼壁塑料培養(yǎng)皿中 (此為第0天)，于38 ℃、5% CO2飽和濕度懸浮培養(yǎng)，每6 h小心搖晃吹打，避免類胚體之間聚集和貼壁，每隔1 d，半量換液。培養(yǎng)3 d后，對形成的類胚體進(jìn)行觀察拍照。

1.4 pAFS向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

為了誘導(dǎo)pAFS向心肌細(xì)胞分化，我們以ACM培養(yǎng)液為基礎(chǔ)，制備了5種誘導(dǎo)條件培養(yǎng)液，包括：1# ACM+0.1 mmol/L Vc、2# ACM+0.1 mmol/L Vc+10 μmol/L 5-aza、3# ACM+10 μmol/L 5-aza、4# ACM+0.1 mmol/L Vc+5 μmol/L 5-aza-d和5# ACM+ 5 μmol/L 5-aza。以常規(guī)ACM培養(yǎng)液作為對照組。在向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，采用了兩種不同的誘導(dǎo)方式：第一種方式，在EBs懸浮培養(yǎng)5 d后將EBs收集在離心管中，在重力作用下使EBs自然沉降到管底部，去除上清后，將EBs再次接入新的3.5 cm非貼壁塑料培養(yǎng)皿中，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)，此時(shí)將培養(yǎng)液更換為上述1#~5#條件誘導(dǎo)液，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)2 d后，于體視顯微鏡下挑選體積較大，邊緣整齊，結(jié)構(gòu)緊密的EBs于48孔板中貼壁培養(yǎng) (2~3個(gè)EBs/孔)。此時(shí)將心肌細(xì)胞誘導(dǎo)液更換為常規(guī)培養(yǎng)液ACM，對照組則一直采用 ACM培養(yǎng)液培養(yǎng)。第二種方式，EBs持續(xù)在ACM培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，于第7天，將EBs轉(zhuǎn)入48孔貼壁培養(yǎng)板培養(yǎng) (2~3個(gè)/孔)，此時(shí)將培養(yǎng)液更換為上述1#~5#條件誘導(dǎo)液。加入誘導(dǎo)液2 d后棄掉誘導(dǎo)液，細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)液ACM中繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。上述實(shí)驗(yàn)處理每組平行重復(fù)3次。在光學(xué)顯微鏡下每天觀察記錄培養(yǎng)板中是否會(huì)出現(xiàn)跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)，如出現(xiàn)則被認(rèn)為是成功分化的心肌細(xì)胞的功能標(biāo)志。作為心肌細(xì)胞分化效率指標(biāo)，詳細(xì)記錄誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的跳動(dòng)頻率、跳動(dòng)持續(xù)時(shí)間，以及不同條件下節(jié)律性跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)占總 EBs數(shù)目的百分比。同時(shí)對跳動(dòng)部位的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行顯微攝像，記錄其收縮情況。跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)所占比例在 3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。數(shù)據(jù)采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

1.5 免疫熒光檢測

對發(fā)生節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行免疫熒光染色，采用的方法是，細(xì)胞團(tuán)經(jīng) 4%多聚甲醛固定 10 min后，PBS洗滌3次，然后在0.2% Triton X-100/PBS中處理10 min，再用PBS洗滌3次，每次5 min，然后在5% FBS/PBS中室溫封閉0.5 h。用1∶100稀釋的一抗 (α-actin，Tnni3) 4 ℃孵育過夜，再次PBS洗滌，然后加入 FITC或 cy3標(biāo)記的二抗(1∶200) 37 ℃孵育1 h，經(jīng)Hochest33342 (5 μg/mL PBS) 染核1 min后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 RNA提取和RT-PCR

取貼壁培養(yǎng) 10 d的跳動(dòng)心肌細(xì)胞團(tuán)，按照Invitrogen公司Trizol試劑說明書，抽提總RNA。并對所得的 RNA進(jìn)行定量測定，A260/A280比值均在1.8~2.0之間，說明提取的 RNA純度高，可用于實(shí)驗(yàn)。取5 μg RNA于含200 U M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶的20 μL反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄。20 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于 PCR檢測。檢測心肌細(xì)胞特異性的基因包括：Tbx5、α-MHC、Tnni3、Gata4等，以 β-actin為內(nèi)參。RT-PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 45 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析并照相。實(shí)驗(yàn)中采用的引物見表1。

表1 用于本研究的PCR引物序列Table1 Target primers used in this study

1.7 電鏡觀察

EBs貼壁培養(yǎng)10 d后，選取節(jié)律性跳動(dòng)心肌細(xì)胞團(tuán)收集于1.5 mL離心管中[12]，1 500 r/min離心10 min后去上清，自管壁小心加入3%戊二醛固定液，將離心下來的細(xì)胞團(tuán)固定后送往第四軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行透射電鏡鏡檢，觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬pAFS細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

從豬羊水中分離的細(xì)胞經(jīng)過5~12 d時(shí)間培養(yǎng)，出現(xiàn)的原代細(xì)胞形態(tài)主要為類上皮樣和類成纖維樣細(xì)胞 (圖1A)。隨著傳代次數(shù)增加，類上皮樣細(xì)胞逐漸減少直至消失，留下的為成纖維樣細(xì)胞 (圖1B)，經(jīng)過細(xì)胞生物學(xué)和分析生物學(xué)檢測，這種成纖維樣間質(zhì)細(xì)胞為豬pAFS細(xì)胞[11]。

培養(yǎng)pAFS細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí)，用胰酶消化后接入非貼壁的培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)24 h，此時(shí)形成的類胚體 (EBs) 體積較小，結(jié)構(gòu)較疏松。EBs懸浮培養(yǎng) 7 d后，邊緣整齊，結(jié)構(gòu)致密 (圖 2A)。將EBs接到貼壁培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，24 h后EBs呈貼壁生長 (圖2B)，5~7 d后，貼壁生長的EBs周圍遷出大量長梭形細(xì)胞，有部分細(xì)胞呈排列性生長 (圖2C)。在部分 EBs周圍可發(fā)現(xiàn)遷出的細(xì)胞會(huì)形成新的細(xì)胞克隆團(tuán) (圖 2D)。對誘導(dǎo)分化形成的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，能夠出現(xiàn)節(jié)律性心肌跳動(dòng)現(xiàn)象。細(xì)胞團(tuán)跳動(dòng)頻率從20次/min~110次/min不等，其中大部分細(xì)胞團(tuán)跳動(dòng)頻率處在 60~90次/min。頻率小于60次/min或多于 100次/min的跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)都比較少。跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)能夠持續(xù)跳動(dòng)9 d左右。

2.2 Vc/5-aza對pAFS向心肌細(xì)胞分化的影響

豬 pAFS細(xì)胞在體外能夠自發(fā)分化為心肌樣跳動(dòng)細(xì)胞，但分化效率很低，僅為5.5%。分別用5-aza和Vc處理的EBs，均能得到節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)，且跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)數(shù)量在總細(xì)胞團(tuán)數(shù)量中的比例明顯提高。不管是EBs懸浮培養(yǎng)還是貼壁培養(yǎng)階段加入心肌誘導(dǎo)液，都發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L Vc與5 μmol/L 5-aza聯(lián)合處理組誘導(dǎo)效果最佳，發(fā)生節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)百分比達(dá)30%以上，這表明加入心肌誘導(dǎo)液的時(shí)間對心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效率沒有顯著影響。另外，0.1 mmol/L Vc與5 μmol/L 5-aza聯(lián)合誘導(dǎo)組節(jié)律性跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)所占百分比明顯高于 5 μmol/L 5-aza單獨(dú)誘導(dǎo)組，兩者之間差異極顯著，說明Vc在 pAFS向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)過程中起著非常重要的作用。從圖3中還發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L Vc與10 μmol/L 5-aza聯(lián)合誘導(dǎo)組，跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)所占百分比，雖然顯著高于對照組但是較0.1 mmol/L Vc與5 μmol/L 5-aza聯(lián)合誘導(dǎo)組明顯降低，表明5-aza的濃度也是影響 pAFS向心肌細(xì)胞分化的重要因素(圖 3A、B)。同時(shí)統(tǒng)計(jì)每個(gè)誘導(dǎo)組細(xì)胞團(tuán)持續(xù)跳動(dòng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)除0.1 mmol/L Vc處理組細(xì)胞團(tuán)持續(xù)跳動(dòng)時(shí)間較短 (5 d左右) 外，其余各處理組的細(xì)胞團(tuán)持續(xù)心肌樣跳動(dòng)時(shí)間都在9 d左右 (圖3C、D)。比較不同時(shí)間段加入誘導(dǎo)劑對類胚體持續(xù)跳動(dòng)時(shí)間的影響發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L Vc處理組在EBs貼壁階段加入誘導(dǎo)劑，細(xì)胞團(tuán)持續(xù)跳動(dòng)時(shí)間要比EBs懸浮階段加入誘導(dǎo)劑組平均時(shí)間長3 d；相反，在10 μmol/L 5-aza處理組，EBs貼壁階段加入誘導(dǎo)劑組要比EBs懸浮階段加入誘導(dǎo)劑組，細(xì)胞團(tuán)持續(xù)跳動(dòng)時(shí)間短，方差分析差異顯著 (P＜0.05)，而其余各處理組類胚體持續(xù)跳動(dòng)時(shí)間差異不顯著。

圖1 豬羊水干細(xì)胞分離培養(yǎng)Fig. 1 Morphology of isolated pAFS. (A) pAFS cells in P1 (50×). (B) pAFS cells in P15 (50×).

圖2 豬羊水干細(xì)胞通過類胚體誘導(dǎo)分化Fig. 2 pAFS cells form embryoid bodies and differentiate into cardiomyocyte like cells. (A) EBs cultured in suspension for seven days (50×). (B) EB cultured in adherent dish for 24 h (200×). (C) EB cultured in adherent dish for one week (200×) a lot of cells come out around EB. (D) New cell clones formed during the inducing process (4×).

圖3 節(jié)律性跳動(dòng)心肌細(xì)胞團(tuán)的統(tǒng)計(jì)分析Fig. 3 Statistical analysis of beating cardiomyocyte-like cell clusters. (A,C) The inducing medium was added when EBs were cultured on the ultra-low attachment culture dishes. (B,D) The inducing medium was added when EBs were cultured on the adherent dishes. 0: ACM; 1: ACM+0.1 mmol/L Vc; 2: ACM+0.1 mmol/L Vc+10 μmol/L 5-aza; 3: ACM+10 μmol/L 5-aza; 4: ACM+0.1 mmol/L Vc+5 μmol/L 5-aza; 5: ACM+5 μmol/L 5-aza.

圖4 豬羊水干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的免疫熒光檢測和RT-PCR檢測Fig. 4 Immunocytochemistry and RT-PCR analysis of induced cardiomyocyte derived from pAFS. (A) Cytoskeletal protein a-actin (200×). (B) Cardiac troponin Tnni3 (200×). (C) The expression of cardiomyocyte specific markers detected by RT-PCR.

2.3 免疫熒光、PCR檢測結(jié)果

為檢測誘導(dǎo)分化的跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)是否含有心肌細(xì)胞特異分子標(biāo)記，對跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行了 α-actin和Tnni3蛋白免疫熒光標(biāo)記測定，結(jié)果顯示誘導(dǎo) 17 d后的細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)α-actin和Tnni3陽性 (圖4A1、B1)，而誘導(dǎo)前的EBs呈陰性反應(yīng) (圖4A2、B2)。從節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)中抽提總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)能夠表達(dá)心肌細(xì)胞早期標(biāo)記基因TbX5和Gata4，同時(shí)也能夠表達(dá)控制心肌收縮舒張的基因α-MHC和Tnni3 (圖4C)。這些結(jié)果證明pAFS經(jīng)誘導(dǎo)可分化為心肌樣細(xì)胞。

2.4 透射電鏡檢測結(jié)果

對節(jié)律性跳動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行透射電鏡觀察，結(jié)果表明豬羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的跳動(dòng)心肌細(xì)胞團(tuán)含有組成肌纖維的肌絲、糖原粒、糖原池等結(jié)構(gòu) (圖5A)。但是與正常豬心肌組織電鏡照片比較，未見到組成肌纖維的Z線和肌小結(jié)等結(jié)構(gòu) (圖5B)，說明本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)得到的跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)還處于心肌發(fā)育的早期階段。

3 討論

有關(guān)胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究已有報(bào)道，但是用羊水干細(xì)胞向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的報(bào)道還不多。2007年Chiavegato等報(bào)道人羊水細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞[13]，2009年有科學(xué)家報(bào)道將人羊水細(xì)胞來源的 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞[14]，而關(guān)于 pAFS向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究未見有報(bào)道。在向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)中多采用去甲基化藥物，如胞嘧啶類似物 5-氮胞苷及其衍生物[15-17]。因?yàn)槠淇赏ㄟ^與細(xì)胞內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶的共價(jià)結(jié)合，使部分甲基化沉默基因去甲基化，恢復(fù)表達(dá)活性，同時(shí)可修飾某些基因的表達(dá)或調(diào)節(jié)細(xì)胞分化[17-20]。目前，5-氮胞苷主要應(yīng)用于誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的研究中[21]。亦有研究表明，人胚胎干細(xì)胞暴露于5-aza中可分化為心肌細(xì)胞[22-23]。

2009年有報(bào)道稱維生素C能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[12]。我們在研究中，利用5-氮胞苷為誘導(dǎo)劑的同時(shí)，也加入了維生素C誘導(dǎo)豬羊水干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，旨在檢測維生素 C在 pAFS向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程中是否也具有促進(jìn)作用。同時(shí)我們比較了5-aza和Vc不同組合方式處理下，心肌樣跳動(dòng)EBs的百分比。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的維生素C或與5-aza的聯(lián)合誘導(dǎo)均能夠促使豬羊水干細(xì)胞形成類胚體，并最終形成節(jié)律性跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)。但各處理組跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)占細(xì)胞團(tuán)總數(shù)的百分比不同，其中0.1 mmol/L Vc與5 μmol/L 5-aza聯(lián)合誘導(dǎo)組類胚體跳動(dòng)百分比達(dá)33%，顯著高于對照組的5%。說明找到了pAFS向心肌細(xì)胞分化的一種有效方法，同時(shí)證明了維生素C在心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中起著非常重要的作用。這一結(jié)果與王艷霞等的報(bào)道一致[12]。但是維生素C在心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的分子機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

圖5 透射電鏡檢測Fig. 5 Transmission electron microscope analysis. (A) Experimental group (30 000×). (B) Positive control (50 000×).

TbX5、Gata4之間存在著復(fù)雜的相互作用，在心臟發(fā)育中起主要作用[24]，共同調(diào)控許多下游基因的表達(dá)。α-MHC為肌球蛋白重鏈，控制心肌收縮，在心肌細(xì)胞衰竭過程中轉(zhuǎn)化為 β-MHC[25-26]。Tnni3為心肌肌鈣蛋白，在肌肉收縮和舒張過程中起重要調(diào)節(jié)作用[26]。pAFS分化的節(jié)律性跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)在進(jìn)行RT-PCR分析時(shí)，能夠表達(dá)心肌細(xì)胞早期標(biāo)記基因TbX5、Gata4；成年期占優(yōu)勢的心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記基因α-MHC、Tnni3。α-actin為細(xì)胞骨架蛋白，在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)[26-27]，實(shí)驗(yàn)中對 pAFS細(xì)胞分化而來的節(jié)律性收縮的類胚體進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)α-actin呈陽性表達(dá)。透射電子顯微鏡分析，誘導(dǎo)的節(jié)律性跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)只具有肌絲、糖原粒等結(jié)構(gòu)而不具有Z線和肌小結(jié)等結(jié)構(gòu)，說明貼壁誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d的跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)還處于心肌發(fā)育的早期。對出現(xiàn)這一現(xiàn)象的解釋可能是由于誘導(dǎo)分化時(shí)間還不夠長?？傊诒狙芯恐形覀儗?pAFS向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化做了初步探索，找到了 pAFS向心肌細(xì)胞分化的一種有效方法，加之 pAFS來源豐富，易于獲取，有望成為較胚胎干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞更為理想的替代細(xì)胞。因此，對 pAFS的分化調(diào)控以及參與誘導(dǎo)其向特定組織細(xì)胞分化的因子或信號(hào)分子需要進(jìn)一步研究。

綜上，本研究采用免疫熒光、RT-PCR、透射電子顯微鏡技術(shù)檢測了pAFS在5-aza和Vc誘導(dǎo)條件下分化形成的節(jié)律性跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)，證明pAFS經(jīng)誘導(dǎo)可以分化為心肌樣細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)分析顯示 4# ACM+0.1 mmol/L Vc+5 μmol/L 5-aza聯(lián)合誘導(dǎo)組的誘導(dǎo)效率最高達(dá)到33%。本研究提供了pAFS向心肌細(xì)胞分化的一種有效誘導(dǎo)方法。

REFERENCES

[1] De Coppi P, Bartsch G, Siddiqui M, et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol, 2007, 25(1): 100?106.

[2] De Gemmis P, Lapucci C, Bertelli M, et al. A real-time PCR approach to evaluate adipogenic potential of amniotic fluid-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev, 2006, 15(5): 719?728.

[3] In't Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg-Van Der Keur C, et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells, 2004, 22(7): 1338.

[4] Kolambkar YM, Peister A, Soker S, et al. Chondrogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mol Histol, 2007, 38(5): 405?413.

[5] Wang YQ, Li YP, Wang M. Effects of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on apoptosis of normal cardiomyocytes after myocardial infarction. J Clin Rehab Tissue Eng Res, 2009, 13(14): 2627?2630.王挹青, 李遠(yuǎn)鵬, 王淼. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對心肌梗死后正常心肌細(xì)胞凋亡的影響. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(14): 2627?2630.

[6] Fukuda K. Progress in myocardial regeneration and cell transplantation. Circ J, 2005, 69(12): 1431?1446.

[7] Hamano K, Nishida M, Hirata K, et al. Local implantation of autologous bone marrow cells for therapeutic angiogenesis in patients with ischemic heart disease: clinical trial and preliminary results. Jpn Circ J, 2001, 65(9): 845?847.

[8] Kehat I, Khimovich L, Caspi O, et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol, 2004, 22(10): 1282?1289.

[9] Pons J, Huang Y, Takagawa J, et al. Combining angiogenic gene and stem cell therapies for myocardial infarction. J Gene Med, 2009, 11(9): 743?753.

[10] Wang H, Chen S, Cheng X, et al. Differentiation of human amniotic fluid stem cells into cardiomyocytes through embryonic body formation. Chin J Biotech, 2008, 24(9): 1582?1587.王晗, 陳帥, 程祥, 等. 通過形成類胚體誘導(dǎo)人羊水多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化. 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24(9): 1582?1587.

[11] Lu ZJ, Cheng D, Li JH, et al. Porcine amniotic fluid stem cells isolation and iInduction into adipocytes. J Agr Biotech, 2010, 18(6): 1054?1061.盧志娟, 成德, 李軍華, 等. 豬羊水干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2010, 18(6): 1054?1061.

[12] Wang YX, Chen GA, An TR, et al. Induction of differentiation of Human embryonic stem cells into cardiomyocyte-like cells. Sci China: Ser C, 2009, 39(12): 1136?1145.王艷霞, 陳貴安, 宋天然, 等. 人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化. 中國科學(xué) C輯: 生命科學(xué), 2009, 39(12): 1136?1145.

[13] Chiavegato A, Bollini S, Pozzobon M, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells are rejected after transplantation in the myocardium of normal, ischemic, immuno-suppressed or immuno-deficient rat. J Mol Cell Cardiol, 2007, 42(4): 746?759.

[14] Zhang JH, Wilson GF, Soerens AG, et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circ Res, 2009, 104(4): e30.

[15] Wakitani S, Saito T, Caplan AI. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995, 18(12): 1417?1426.

[16] Yin Q, Zhao Y, Chen W, et al. The induction of P19 cells into myocardium cells using 5-aza cytidine in vitro. Acta Anat Sin, 2007, 38(3): 325?329.尹青, 趙昱, 陳煒, 等. 應(yīng)用5-氮胞苷體外誘導(dǎo) P19細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞. 解剖學(xué)報(bào), 2007, 38(3): 325?329.

[17] Li GQ, Zhang WZ, Ma L, et al. Differentiation of adiposederived mesenchymal stem cells into cardiomyocyte-like cells induced by 5-azacytidine. Med J Natl Defending Forces Northwest Chin, 2009, 30(5): 357?360.李國慶, 張衛(wèi)澤, 馬凌, 等. 5-氮胞苷對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響. 西北國防醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 30(5): 357?360.

[18] Mummery C, ward-van Oostwaard D, Doevendans P, et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation, 2003, 107(21): 2733?2740.

[19] Carpenter MK, Rosler E, Rao MS, et al. Characterization and differentiation of human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells, 2003, 5(1): 79?88.

[20] Dai WD, Kloner RA. Myocardial regeneration by human amniotic fluid stem cells: challenges to be overcome. J Mol Cell Cardiol, 2007, 42(4): 730?732.

[21] Jiang H, Wang HS, Wang ZW, et al. Bone marrow derived from human mesenchymal stem cells induced into cardiomyocytes expressing ANP, BNP, α-skeletal actin, MLC-2v,GATA-4 and Nkx2.5. J Cardiovasc Pulm Dis, 2010, 29(1): 43?48.姜輝, 王輝山, 汪曾煒, 等. 體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞的基因表達(dá). 心肺血管病雜志, 2010, 29(1): 43?48.

[22] Xu CH, Police S, Rao N, et al.Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Circ Res, 2002, 91(6): 501?508.

[23] Hua JL, Ma YJ, Yang YA, et al. Stem cells and cardiomyocytes transplantation therapy. Chin Bull Life Sci, 2004, 16(4): 215?220, 225.華進(jìn)聯(lián), 馬勇江, 楊玉艾, 等. 干細(xì)胞與心肌細(xì)胞替代治療. 生命科學(xué), 2004, 16(4): 215?220, 225.

[24] Yamada Y, Sakurada K, Takeda Y, et al. Single-cell-derived mesenchymal stem cells overexpressing Csx/Nkx2. 5 and GATA4 undergo the stochastic cardiomyogenic fate and behave like transient amplifying cells. Exp Cell Res, 2007, 313(4): 698?706.

[25] Cheng ZK, Ou LL, Zhou X, et al. Targeted migration of mesenchymal stem cells modified with CXCR4 gene to infarcted myocardium improves cardiac performance. Mol Ther, 2008, 16(3): 571?579.

[26] Kurabayashi M, Tsuchimochi H, Komuro I, et al. Molecular cloning and characterization of human cardiac-α and β-from myosin heavy chain complementary DNA clones. Regulation of expression druing development and pressure overload in human atrium. J Clin Invest, 1988, 82(2): 524?531.

[27] Lavon N, Benvenisty N. Differentiation and genetic manipulation of human embryonic stem cells and the analysis of the cardiovascular system. Trends Cardiovas Med, 2003, 13(2): 47?52.