陸月，劉丹，張孝任，劉雪榮，沈煒，鄭剛，柳云帆，董小巖,，吳小兵，高基民

1 溫州醫(yī)學院 浙江省模式生物技術(shù)與應用重點實驗室，溫州 325035

2 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 病毒基因工程國家重點實驗室，北京 100052

3 北京五加和分子醫(yī)學研究有限公司，北京 100176

哺乳動物細胞表達系統(tǒng)具有指導蛋白質(zhì)的正確折疊、提供復雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能。因此，對于用基因工程方法獲得結(jié)構(gòu)復雜的高等生物蛋白質(zhì)具有優(yōu)勢。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)不僅已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺，在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起了極為重要的作用。CHO/dhfr缺陷型細胞表達系統(tǒng)是最為常用的哺乳動物表達系統(tǒng)，用該系統(tǒng)成功地獲得了多種重組蛋白的高效表達[1-3]。然而，這種表達系統(tǒng)需要漫長的篩選加壓過程才能得到高產(chǎn)量的穩(wěn)定細胞株，故不適合于短時間內(nèi)獲得較大量重組蛋白。

瞬時表達系統(tǒng)因?qū)嶒炛芷诙蹋僮骱啽愣艿角嗖A。常用的瞬時表達系統(tǒng)有 COS-7細胞系統(tǒng)[4]、桿狀病毒載體表達系統(tǒng)[5]、腺病毒載體/HEK293細胞表達系統(tǒng)[6]等。

本實驗利用重組腺病毒能高效感染哺乳動物細胞及高效表達外源基因的特點，擬建立一種不需要轉(zhuǎn)染和加壓篩選的腺病毒載體/BHK21細胞表達系統(tǒng)，并用于快速制備重組可溶性腫瘤壞死因子受體與脂聯(lián)素球部融合蛋白 (sTNFRII-gAD)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細胞及試劑

pBHGlox(delta)E1,3Cre骨架質(zhì)粒、pDC316原始質(zhì)粒、BHK21c022細胞、無血清培養(yǎng)基和磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染試劑盒由北京五加和分子醫(yī)學研究所提供；L929細胞購自美國ATCC，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；蛋白Marker購自Invitrogen公司；放線菌素 D購自 Fluka；鼠抗人脂聯(lián)素單抗由譚淑萍老師提供；鼠抗人 TNFRII單抗購自abcam公司；馬抗小鼠 IgG/磷酸酶標記抗體購自中杉金橋公司；BCIP/NBT購自 Calbiochem公司；重組人TNFα標準品購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Superdex 200 prep grade (16/60) 購自 GE Healthcare。

1.2 融合基因的構(gòu)建及重組腺病毒的產(chǎn)生

以融合蛋白基因 pAAV2neo-sTNFRII-gAD為模板設計引物。上游引物為5′-CGCGGATCC ATGGCG CCCGTCGCC-3′，下游引物為5′-ACGCGTCGACTC AGTTGGTGTCATG-3′，下劃線處表示酶切位點，上游引物的酶切位點為 BamHⅠ，下游引物的酶切位點為SalⅠ。引物合成由Invitrogen公司完成。PCR擴增條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收試劑盒回收目的片段，將片段用BamHⅠ、SalⅠ進行雙酶切。再用BglⅡ和 SalⅠ雙酶切載體 pDC316。BamHⅠ和 BglⅡ是同尾酶，用T4 DNA連接酶將上述目的基因片段和pDC316片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到重組穿梭質(zhì)粒pDC316-sTNFRII-gAD。

將 pDC316-sTNFRII-gAD和腺病毒基因組質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，用磷酸鈣共沉淀法進行轉(zhuǎn)染。在6孔細胞培養(yǎng)板中接種HEK293細胞，5×105個細胞/孔，培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)染前4~6 h換新鮮培養(yǎng)基 (含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)；取4 μg的DNA與水混合成總體積為67.5 μL的液體加入到EP管中。然后加入2.5 mol/L CaCl27.5 μL，混勻后4 ℃孵育20 min；向EP管中貼壁加入2×HBS (4 ℃保存) 75 μL，輕柔地混勻后室溫靜置5 min。最后將150 μL液體加入6孔細胞培養(yǎng)板中，輕輕混勻。鏡下觀察可以看到十分細小而均勻的顆粒；37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。9 d后見到病毒噬斑，收集病變細胞和上清作為Ad5-sTNFRII-gAD毒種。

1.3 重組腺病毒的制備與純化

將獲得的Ad5-sTNFRII-gAD毒種委托北京五加和分子醫(yī)學研究所進行擴增和純化，得到滴度為1×1015vg/L的純化病毒。用TCID50方法[7]測定腺病毒的感染性滴度。

1.4 Ad5-EGFP對BHK21c022細胞的感染

在 24孔細胞培養(yǎng)板中接種 BHK21c022細胞(含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)，1×105個細胞/孔，同時按梯度加入重組腺病毒Ad5-EGFP (MOI分別為0、1、10、100、1 000)，共5個孔。12 h后換成無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下觀察，在相同的曝光時間 (1/3 s) 觀察各孔中細胞的熒光強弱以及細胞的形態(tài)變化。

1.5 Western blotting檢測

用MOI分別為0、1、10、100、1 000的重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD感染BHK21c022細胞，12 h后換成無血清培養(yǎng)基。48 h后收取細胞無血清培養(yǎng)上清。將上清和無水乙醇按 1∶3的比例混合到一起，?70 ℃放置0.5 h。13 000 r/min 離心5 min，倒掉上清，用少量 (一般為收取上清體積的 1/10) PBS溶液溶解沉淀，用于做 SDS-PAGE及 Western blotting實驗。

取10 μL濃縮10倍的上清，加入10 μL 2×上樣緩沖液，100 ℃沸水煮5 min，20 μL樣品上樣，12%分離膠進行SDS-PAGE分離，然后用濕膠轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜。取出NC膜，用封閉液(5%脫脂牛奶，PBS配制) 37 ℃封閉NC膜1 h。棄去封閉液，加入1∶300 (用封閉液稀釋) 的鼠抗人脂聯(lián)素單抗或 1∶500 (用封閉液稀釋) 的鼠抗人TNFRII的單抗，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌NC膜3次后，加入 1∶1 000 (用封閉液稀釋) 的馬抗小鼠IgG/磷酸酶標記抗體37 ℃孵育1 h。PBS洗滌NC膜3次后，加入BCIP/NBT，避光顯色。約15~30 min后棄去顯色液，用超純水洗滌 NC膜中止反應，觀察結(jié)果。

1.6 蛋白點雜交方法檢測sTNFRII-gAD蛋白

用MOI為100的重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gAD感染BHK21c022細胞12 h后，換成無血清培養(yǎng)基，然后每隔48 h換液，多次收集培養(yǎng)液上清，進行蛋白質(zhì)點雜交實驗。

將每次收集的細胞培養(yǎng)上清各取5 μL，分別點到NC膜上，用封閉液 (5%脫脂牛奶，PBS配制) 37 ℃封閉NC膜1 h。棄封閉液，加入1∶300 (用封閉液稀釋) 的鼠抗人脂聯(lián)素單抗，37 ℃孵育 1 h。PBS洗滌NC膜3次后，加入1∶1 000 (用封閉液稀釋) 的馬抗小鼠IgG/磷酸酶標記抗體37 ℃孵育1 h。PBS洗滌NC膜3次后，加入BCIP/NBT，避光顯色。約15~30 min后棄去顯色液，用超純水洗滌NC膜中止反應，觀察結(jié)果。

1.7 sTNFRII-gAD蛋白的濃縮和純化

用MOI為100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5個轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的 BHK21c022細胞來大量制備sTNFRII-gAD融合蛋白。每個轉(zhuǎn)瓶加無血清培養(yǎng)液100 mL，每48 h收獲上清一次并換液，反復6次收取培養(yǎng)上清。共得到約3 L含有融合蛋白的細胞培養(yǎng)上清。向上清中緩慢均勻的加入硫酸銨粉末(40%，W/V)。用磁力攪拌器在4 ℃冷庫中攪拌24 h。13 000× g，1 h離心后棄去上清。用少量的PBS溶解沉淀 (3~5 mL)。然后將溶液進行透析，除去多余的硫酸銨，得到重組融合蛋白的粗純品。依據(jù)Hiload 16/60 Superdex 200 prep grade的說明書對得到的粗純品進行凝膠過濾層析。將層析后各個收集峰進行免疫印跡分析，收集含有目標融合蛋白的峰合并獲到融合蛋白純品。

1.8 sTNFRII-gAD融合蛋白的活性測定

96孔細胞培養(yǎng)板中鋪入 L929細胞，1.5×104~1.8×104個細胞/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。第2天，將sTNFRII-gAD融合蛋白純品，用含放線菌素D 20 mg/L，TNFα 20 U/mL的DMEM培養(yǎng)液進行4倍比梯度稀釋，共稀釋10個梯度；棄去96孔板中L929細胞的上清，加入前面已經(jīng)倍比稀釋好的sTNFRII-gAD融合蛋白樣品，每孔100 μL，每個梯度做3個復孔；同時加入放線菌素D 20 mg/L與TNFα 20 U/mL的DMEM培養(yǎng)液(兩者結(jié)合殺傷性最大) 作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液 (5 g/L) 20 μL，再培養(yǎng)4 h后，將96孔中的120 μL液體吸出，換入100 μL DMSO終止培養(yǎng)。檢測各孔的OD570值[8-9]。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒Ad5-EGFP感染BHK21 c022細胞

分別用 MOI為 0、1、10、100、1 000的Ad5-EGFP感染BHK21 c022細胞，熒光顯微鏡下觀察。如圖1所示，隨著MOI的增大，熒光細胞數(shù)量和亮度逐漸增強，表明腺病毒載體能夠有效轉(zhuǎn)染BHK21 c022細胞，并且表達量與病毒用量呈正相關。但在MOI達到1 000時，出現(xiàn)細胞變長、少數(shù)細胞死亡的現(xiàn)象。

2.2 重組載體質(zhì)粒pDC316-sTNFRII-gAD的鑒定及重組腺病毒的獲得

用 XbaⅠ和 HindⅢ雙酶切 pDC316-sTNFRII-gAD應得到大小為3 777 bp和1 327 bp的基因片段，SalⅠ和 EcoRⅠ雙酶切應得到3 883 bp和1 221 bp的基因片段；圖 2顯示酶切結(jié)果與預期相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 不同MOI的rAd5-EGFP對BHK21 c022細胞的轉(zhuǎn)導效率Fig. 1 Transduction efficiency of Ad5-EGFP virus at different MOI for BHK21 c022 cells.

圖2 pDC316-sTNFRII-gAD質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 2 Restriction digestion analysis of pDC316-sTNFRII-gAD plasmid. 1: DNA marker; 2: pDC316-sTNFRII-gAD digested with Sal I and EcoR I; 3: pDC316-sTNFRII-gAD digested with Xba I and Hind III; 4: pDC316-sTNFRII-gAD.

將重組穿梭質(zhì)粒 pDC316-sTNFRII-gAD與腺病毒基因組質(zhì)粒 pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，9 d后見到病毒噬斑，如圖3所示。收集病變細胞和上清作為Ad5-sTNFRII-gAD毒種。大量制備和純化獲得 Ad5-sTNFRII-gAD制品。TCID50方法測定純化的Ad-sTNFRII-gAD病毒的感染性滴度為1.58×1013IU/L。

2.3 不同MOI的Ad5-sTNFRII-gAD的表達效率

將無血清培養(yǎng)48 h后的細胞培養(yǎng)上清濃縮后進行Western blotting檢測，結(jié)果如圖4所示。用脂聯(lián)素單抗 (圖4A) 和腫瘤壞死因子單抗 (圖4B) 檢測都出現(xiàn)了一致的特異性條帶，分別為sTNFRII-gAD融合蛋白的單體、三聚體和多聚體形式，其表達效率隨著重組腺病毒MOI的提高而增加。

圖 3 共轉(zhuǎn)染 pBHGlox(delta)E1,3Cre和 pDC316-sTNFRII-gAD后產(chǎn)生重組腺病毒Ad5-sTNFRII-gADFig. 3 Plaques of recombinant virus Ad5-sTNFRII-gAD generated by co-transfection of pDC316-sTNFRII-gAD and pBHGlox(delta)E1,3Cre.

2.4 sTNFRII-gAD融合蛋白的持續(xù)表達

Ad5-sTNFRII-gAD感染無血清培養(yǎng)的 BHK21 c022細胞后，48 h收集細胞上清，連續(xù)收集6次，用蛋白點雜交方法檢測其中sTNFRII-gAD的表達。用已知濃度的 sTNFRII-Fc融合蛋白作為標準品，分別稀釋成100、50、10、5、1 mg/L，膜上各加樣5 μL。結(jié)果如圖 5所示，可見經(jīng)重組腺病毒感染過的BHK21 c022細胞在2~10 d內(nèi)都持續(xù)分泌較高濃度的融合蛋白。

圖4 sTNFRII-gAD融合蛋白的免疫印跡分析Fig. 4 Western blotting analysis of sTNFRII-gAD fusion protein. (A) Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein with monoclonal antibody against adiponectin. (B) Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein with monoclonal antibody against TNFRII. Lane 1: Protein molecular weight standards; Lanes 2 to 6: Western blotting of non-reduced sTNFRII-gAD fusion protein at 1 000 MOI, 100 MOI 10 MOI, 1 MOI and 0 MOI of Ad5-sTNFRII-gAD.

圖5 蛋白點雜交分析驗證融合蛋白的持續(xù)表達Fig. 5 Confirmation of continuous expression of the fusion protein sTNFRII-gAD by protein dot blotting with monoclonal antibody against TNFRII. (A) Lanes 1 to 5: positive controls at 5 μL of 100 μg/L, 50 μg/L, 10 μg/L, 5 μg/L and 1 μg/L; (B) Lanes 1 to 5: detection of sTNFRII-gAD fusion protein in the supernatants of BHK-21S cells after the culture of 48 h, 96 h, 144 h, 192 h and 240 h.

2.5 sTNFRII-gAD的分子篩層析純化及生物學活性鑒定

分子篩純化重組融合蛋白時，出現(xiàn) 2個比較明顯的峰，如圖6所示。第1個峰為外水峰 (峰1)，是分子量相對較大的高聚體峰。而第 2個峰主要為融合蛋白的三聚體峰 (峰 2)，收集該峰，并測定其對TNFα殺傷L929細胞的中和活性。結(jié)果顯示，通過腺病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)出來的融合蛋白sTNFRII-gAD具有中和TNFα的活性 (圖7)，且其抑制TNFα殺傷L929細胞的活性呈劑量依賴性。

圖6 sTNFRII-gAD融合蛋白的分子篩層析Fig. 6 Map of size exclusion chromatography of sTNFRII-gAD fusion protein. Peak1: multimers of sTNFRII-gAD in external solution; Peak2: trimer of sTNFRII-gAD.

3 討論

目前利用哺乳動物表達系統(tǒng)生產(chǎn)高生物學活性的蛋白是獲得重組蛋白最為廣泛的方式。其中應用最普遍的是 CHO/dhfr?表達系統(tǒng)[10-11]。CHO細胞很少分泌內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的表達和分離純化，而且表達的外源蛋白保持天然的空間結(jié)構(gòu)和生物學活性。所以 CHO表達系統(tǒng)常用于長期穩(wěn)定表達重組蛋白。但是得到高效穩(wěn)定表達重組蛋白的 CHO細胞株需要漫長的加壓過程，不能滿足短期快速得到蛋白純品的要求。

圖7 sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα的活性測定Fig. 7 TNFα neutralizing activity of the purified sTNFRII-gAD fusion protein.

病毒載體因能高效感染宿主細胞及表達外源基因而被用于瞬時高效表達[12]。常用的病毒載體有桿狀病毒載體、甲病毒SFV (semliki森林病毒) 載體、腺病毒載體等。其中腺病毒表達載體系統(tǒng)因安全性好、高效感染哺乳動物細胞、高效表達外源基因等優(yōu)點而在重組蛋白制備方面得到應用。尤其是該表達系統(tǒng)對重組蛋白的糖基化、磷酸化等翻譯后加工等過程與人體天然過程相似，因此表達的蛋白具有高生物活性[13-14]。

sTNFRII-gAD融合蛋白是一種雙功能蛋白質(zhì)分子，sTNFRII可以與TNFα結(jié)合，減輕炎癥的發(fā)生，達到治療類風濕性關節(jié)炎等疾病的目的。已經(jīng)上市的 TNFα拮抗藥物 sTNFRII-Fc是二聚體形式的sTNFRII。但 TNFα天然狀態(tài)下是三聚體形式，重組蛋白sTNFRII-gAD是利用了脂聯(lián)素球部自動形成三聚體的特性而設計的，預計獲得的三聚體化sTNFRII-gAD融合蛋白拮抗TNFα的活性將比二聚體化 sTNFRII-Fc更高。本研究嘗試用重組腺病毒載體/BHK21細胞表達系統(tǒng)來制備三聚體化的sTNFRII-gAD融合蛋白。

制備腺病毒載體最常見的生產(chǎn)細胞是 HEK293細胞[15]，它能夠反式提供E1基因功能，使E1基因缺失的重組腺病毒能夠高效復制和產(chǎn)生子代病毒，在這個過程中外源基因也得到高效表達。故目前也常用腺病毒載體/HEK293細胞來生產(chǎn)重組蛋白[16]。然而，利用重組腺病毒感染HEK293細胞會產(chǎn)生明顯的細胞病變，只能一次性收獲產(chǎn)物，而不能較持續(xù)地表達外源蛋白及反復多次收獲細胞上清來制備目標蛋白。另外利用HEK293細胞生產(chǎn)重組蛋白的同時，會產(chǎn)生子代病毒，具有感染性，并且病毒自身的蛋白會影響重組蛋白的純化。

本研究采用了 BHK21細胞作為重組蛋白的生產(chǎn)細胞。BHK21c022細胞是一種從BHK21細胞中單克隆化挑選并且無血清馴化的懸浮適應細胞株，生長迅速，適應性強，既可以在含有血清的培養(yǎng)液中貼壁生長，又可以在無血清的培養(yǎng)液中懸浮生長。為了觀察腺病毒載體對于 BHK21c022細胞的轉(zhuǎn)染和表達效率以及細胞毒性，我們用不同量的rAd5-EGFP病毒感染BHK21c022細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雖然該細胞是小鼠來源的細胞，但對rAd5-EGFP病毒感染仍然十分敏感，并且感染和表達效率隨著病毒MOI的增加而明顯增加。細胞毒性只有在很高的用量 (MOI=1 000) 時才明顯 (圖1)。這為我們建立腺病毒載體/BHK21細胞表達系統(tǒng)以及選擇病毒的用量提供了依據(jù)。

同理，我們構(gòu)建并重組獲得了 rAd5-sTNFRII-gAD病毒。用該重組病毒感染BHK2c022細胞，在上清中成功檢測到了 sTNFRII-gAD融合蛋白的表達，并且發(fā)現(xiàn)：rAd5-sTNFRII-gAD病毒用量的增加，上清中的 sTNFRII-gAD表達量也呈明顯增加趨勢(圖4)；利用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，在換成無血清培養(yǎng)基后連續(xù)培養(yǎng)了 12 d，反復 6次收集上清；且 6次上清中sTNFRII-gAD蛋白表達量相對穩(wěn)定 (圖5)，這說明腺病毒載體表達系統(tǒng)可以短期穩(wěn)定表達重組蛋白。另外。用復制缺陷型腺病毒載體感染BHK21c022細胞，再用LK021培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，由于LK021是無血清、無蛋白和多肽的化學成分限定的培養(yǎng)液，收獲的培養(yǎng)上清中雜蛋白很少，對純化非常有利。因此，BHK21c022細胞是用腺病毒載體表達系統(tǒng)表達重組蛋白的理想細胞株。

總而言之，本實驗建立了一種用腺病毒載體/ BHK21細胞系統(tǒng)表達和制備重組 sTNFRII-gAD融合蛋白的方法，從而為快速高效獲得較大量 (毫克級)、結(jié)構(gòu)復雜并具有生物學活性的重組蛋白提供了有力工具。

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