李春麗，韓露，鄭振宇，趙衛(wèi)東

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002

植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的密碼子優(yōu)化及其在畢氏酵母中的表達(dá)

李春麗，韓露，鄭振宇，趙衛(wèi)東

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002

根據(jù)甜蛋白des-pGlu1-Brazzein的成熟區(qū)氨基酸序列，按照酵母密碼子的偏好優(yōu)化其編碼序列，合成了4對(duì)末端具粘合位點(diǎn)的寡聚核苷酸序列，經(jīng)連接、PCR擴(kuò)增后得到了179 bp的des-pGlu1-Brazzein編碼序列，插入到pPIC9K載體中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pPIC9K-Bra。經(jīng)酶切、電擊轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌GS115中。酵母工程菌株經(jīng)篩選鑒定后誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白的表達(dá)量約占上清總蛋白的51.6%，分離純化后的des-pGlu1-Brazzein具有一定的甜度。

甜蛋白，畢氏酵母，表達(dá)，活性檢測(cè)

然而天然甜蛋白的開發(fā)生產(chǎn)受到資源、產(chǎn)地的限制，難以規(guī)?；a(chǎn)，人工合成的甜蛋白價(jià)格昂貴，限制了它的應(yīng)用。因此，利用工程技術(shù)生產(chǎn)des-pGlu1-Brazzein具有重要意義。由于des-pGlu1-Brazzein發(fā)現(xiàn)較晚，對(duì)于其基因工程的研究還較少，主要是在原核生物大腸桿菌和乳酸球菌中表達(dá)[4-5]，我們也曾經(jīng)優(yōu)化了des-pGlul-Brazzein的編碼序列，使其在大腸桿菌得到了高效表達(dá)[6-7]。但是存在的主要問題是得到的產(chǎn)物以包涵體的形式存在，純化后的 des-pGlu1-Brazzein還需要進(jìn)一步的復(fù)性才具有活性。為克服這些缺點(diǎn)，本研究按照酵母密碼子的偏愛優(yōu)化了des-pGlu1-Brazzein (Bra) 編碼序列，采用目前廣泛使用的畢氏酵母 Pichia pastoris作為宿主菌，構(gòu)建了des-pGlu1-Brazzein高效分泌表達(dá)的酵母工程菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

4對(duì)編碼des-pGlu1-Brazzein的寡聚核苷酸片段和2對(duì)引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PUC18-T載體購自上海生物工程公司。pPIC9K載體和GS115酵母菌株購自Invitrogen 公司。TG1菌株為本試驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 酶和試劑

T4 DNA連接酶、T4多核苷酸激酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、EX Taq酶購自大連寶生物工程有限公司。PCR純化試劑盒購自賽百勝公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MD培養(yǎng)基：1.34% YNB，0.000 04%生物素，2%葡萄糖，1.5%瓊脂；

MM培養(yǎng)基：1.34% YNB，0.000 04%生物素，0.5%甲醇，1.5%瓊脂；

BMGY培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，0.000 04%生物素，1%甘油，0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.0；

BMMY培養(yǎng)基：將BMGY中的1%甘油用0.5%的甲醇替代。

1.1.4 主要儀器和設(shè)備

多功能熒光分析系統(tǒng) (Eagle eye) 及其分析軟件Gel-ProAnalyzer(3.1) 購自美國冷泉港儀器公司，電擊轉(zhuǎn)化儀購自美國伯樂公司?；虻臏y(cè)序由上海生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 des-pGlu1-Brazzein基因的設(shè)計(jì)合成

根據(jù) des-pGlu1-Brazzein的氨基酸序列和酵母對(duì)密碼子的偏愛設(shè)計(jì) 4對(duì)編碼 des-pGlu1-Brazzein的末端具粘合位點(diǎn)的寡聚核苷酸片段[8-9]，每段寡核苷酸長(zhǎng)度30~59 nt不等。正負(fù)鏈之間互補(bǔ)區(qū)至少25 nt以上。在結(jié)構(gòu)基因的兩端分別設(shè)置了酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和NotⅠ，在3′端加上2個(gè)終止密碼子。合成的片段和2對(duì)引物如表1所示。

1.2.2 des-pGlu1-Brazzein基因的克隆和鑒定

除Bra-1和Bra-4′的2個(gè)5′端片段以外，其余的6個(gè)片段均用T4多核苷酸激酶磷酸化。所有片段等比例混合后94 ℃變性1~2 min室溫冷卻，然后加入T4 DNA連接酶于12 ℃~16 ℃連接過夜。以連接反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，以合成的Bra和 Bra′為上下游引物按下列條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃熱變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物純化后，與 PUC18-T載體于12 ℃~16 ℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含 Amp抗性的 LB培養(yǎng)基上 (含X-gal、IPTG)，37 ℃培養(yǎng)過夜。

表1 合成的序列Table 1 The synthesized sequence

培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)的白色菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及其酶切鑒定，最后進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3 表達(dá)載體pPIC9K-Bra的構(gòu)建和鑒定

將測(cè)序正確的質(zhì)粒和 pPIC9K載體分別進(jìn)行雙酶切，1.0%的瓊脂糖電泳分別回收目的基因和pPIC9K載體，而后用T4 DNA連接酶連接過夜。連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 TG1感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于含Amp的LB培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)過夜。

將在含Amp的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒同樣進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)。最后進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化畢氏酵母

將測(cè)序正確的載體用限制性內(nèi)切酶 SalⅠ進(jìn)行酶切，純化后取10 μL轉(zhuǎn)化80 μL的酵母感受態(tài)細(xì)胞，電擊后立即加入冰冷的 1 mol/L山梨醇，取200~600 μL涂布于MD培養(yǎng)基上，2~6 d后觀察轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)。

1.2.5 整合轉(zhuǎn)化子的篩選和PCR鑒定

挑取在MD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，在96孔板中培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，使每一個(gè)克隆的細(xì)胞密度都相同，然后分別點(diǎn)種10 μL于MM、MD培養(yǎng)基及其含不同濃度G418 (0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、 4 g/L) 的YEPD培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)2~3 d，篩選具有高 G418抗性且生長(zhǎng)良好的菌株進(jìn)行菌落PCR，以 AOX1和 AOX1′為引物進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增的條件是：94 ℃ 1 min ，54 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。

1.2.6 表達(dá)菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及電泳檢測(cè)

接種單菌落于25 mL的BMGY培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)OD600至2~6 (約16~18 h)，離心收集菌體，用等量的BMMY培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，每日補(bǔ)加甲醇至終濃度為0.5%，誘導(dǎo)6 d，取樣品上清液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。

1.2.7 des-pGlu1-Brazzein的純化和活性檢測(cè)

將獲得的des-pGlu1-Brazzein用透析袋透析，80 ℃加熱 30 min后離心以獲得小分子量的des-pGlu1-Brazzein，SDS-PAGE檢測(cè)純化的情況。通過 6人品嘗，確定純化后的 des-pGlu1-Brazzein的甜度[6]，即將純化的 des-pGlu1-Brazzein采用BCA測(cè)定濃度，而后調(diào)整其濃度為 0.02%的母液(即1 mL水中含0.02 mg 的純化蛋白)，進(jìn)一步獲得稀釋成 2、4、6、8、10倍等不同稀釋倍數(shù)的待測(cè)溶液。用 2%的蔗糖作為對(duì)照，通過品嘗確定與之相當(dāng)?shù)奶鸲鹊膁es-pGlu1-Brazzein的稀釋倍數(shù)。計(jì)算公式為：相對(duì)甜度=稀釋倍數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 des-pGlu1-Brazzein的基因合成及其克隆

合成的des-pGlu1-Brazzein編碼序列經(jīng)T4 DNA連接酶連接后作為模板，以Bra和Bra′為上下游引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物大小約180 bp，與預(yù)期相符。回收PCR產(chǎn)物，將其連接到T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒T-Bra。重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定結(jié)果如圖1所示。PCR擴(kuò)增和雙酶切的結(jié)果都證明目的基因連接在 T載體上。最后測(cè)序的結(jié)果表明所連接的目的基因與所設(shè)計(jì)的基因序列完全一致。

2.2 表達(dá)載體 (pPIC9K-Bra) 的鑒定

將測(cè)序正確的 T-Bra和 pPIC9K同時(shí)進(jìn)行雙酶切，純化回收的 des-pGlu1-Brazzein基因片段與pPIC9K連接，構(gòu)建重組載體 pPIC9K-Bra。以重組載體為模板，以AOX1和AOX1′為上下游引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出了目的DNA片段，結(jié)果如圖2A所示。圖中顯示，陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增出任何片段，空載的質(zhì)粒 pPIC9K擴(kuò)增出一條約 500 bp的條帶，此為AOX1基因片段 (494 bp)，pPIC9K-Bra擴(kuò)增出一條約700 bp的目的條帶，此為AOX1基因片段 (494 bp)加上Bra基因 (180 bp)。用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pPIC9K-Bra的結(jié)果如圖2B所示，箭頭所示為目的條帶。質(zhì)粒的測(cè)序檢測(cè)結(jié)果也表明，插入的基因與所設(shè)計(jì)的目的基因完全一致。

2.3 GS115-pPIC9K-Bra酵母工程菌株的篩選和鑒定

2.3.1 抗性篩選

將測(cè)序正確的pPIC9K-Bra載體用SalⅠ進(jìn)行單酶切并經(jīng)純化回收后，電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母細(xì)胞GS115，涂布于MD培養(yǎng)基上。

在MD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落經(jīng)過96孔板的3次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，將每孔細(xì)胞分別點(diǎn)種于MM、MD培養(yǎng)基及含不同濃度G418的YEPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)。篩選到的工程菌株在MM和MD的培養(yǎng)基上均可以生長(zhǎng)，證明其表型為Mut+；篩選到的工程菌株在含0.25 g/L和0.5 g/L的G418平板上都可以生長(zhǎng)，在含1 g/L的G418的平板上有50多個(gè)菌株生長(zhǎng)。1.5 g/L時(shí)僅4株菌生長(zhǎng)。而對(duì)照菌株GS115在G418為0.25 g/L時(shí)就不能生長(zhǎng)。

2.3.2 PCR檢測(cè)

以篩選到高G418抗性的重組子菌落為模板，以AOX1和AOX1′為上下游引物進(jìn)行PCR，結(jié)果如圖3所示。陰性對(duì)照未擴(kuò)增出任何片段，陽性菌落對(duì)照擴(kuò)增出了一條約2 200 bp的片段，此為AOX1基因。以SalⅠ酶切線性轉(zhuǎn)化的菌落擴(kuò)增出兩條帶，一條為AOX1基因 (Mut+)，一條為目的片段，箭頭所示。但第 6、9泳道無目的片段，為假陽性。共得到了 30多個(gè)整合子。

圖1 T-Bra的PCR和酶切鑒定Fig. 1 Identification of T-Bra by PCR (A) and enzyme digestion (B). (A) M: DNA marker; 1: control; 2?4: PCR product from T-Bra. (B) M: DNA marker; 1?2: T-Bra digested with EcoR I and Not I.

圖2 pPIC9K-Bra的PCR和酶切鑒定Fig. 2 Identification of pPIC9K-Bra by PCR (A) and enzyme digestion (B). (A) M: DNA marker; 1: control; 2: PCR product from pPIC9K; 3: PCR product from pPIC9K-Bra. (B) M: DNA marker; 1: pPIC9K-Bra digested with EcoR I and Not I.

圖3 重組酵母的菌落PCR鑒定Fig. 3 Identification of recombinant yeast by strain PCR. M: DNA marker; 1: control; 2: PCR product from GS115-pPIC9K; 3?16: PCR product from GS115-pPIC9K-Bra.

2.4 GS115-pPIC9K-Bra的誘導(dǎo)表達(dá)

從高抗G418平板上挑取的菌落，經(jīng)PCR檢測(cè)后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，每隔24 h補(bǔ)加甲醇至0.5%。誘導(dǎo)表達(dá)6 d，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳驗(yàn)證結(jié)果如圖4所示。圖4顯示GS115-pPIC9K-Bra比對(duì)照多表達(dá)了一條約9 kDa的目的蛋白，箭頭所示。表達(dá)量約占上清總蛋白的51.6%。

2.5 des-pGlu1-Brazzein的純化和活性分析

將獲得的分泌表達(dá)的上清液用透析袋透析后，80 ℃加熱 30 min，離心以獲得小分子量的 despGlu1-Brazzein，SDS-PAGE檢測(cè)純化的情況如圖4所示，從圖中可以看到，目的蛋白得到了純化。通過品嘗的方法檢測(cè)，表達(dá)的des-pGlu1-Brazzein有一定的甜度，約為蔗糖甜度的200倍。

圖4 表達(dá)和純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expressed and purified des-pGlu1-Brazzein. 1?2: purified target protein; 3?4: the supernatant of GS115-pPIC9K-Bra after induction; 5: the supernatant GS115-pPIC9K after induction; M: protein marker.

3 討論

des-pGlu1-Brazzein是目前為止所發(fā)現(xiàn)的甜度最高的蛋白，是一種理想的蔗糖替代品，可以滿足肥胖癥、糖尿病等患者對(duì)甜味的需求。但是該蛋白天然資源有限，因此，研究利用基因工程的方法生產(chǎn)該蛋白具有重要意義?；诖竽c桿菌等原核生物表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)，本研究采用畢赤酵母Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該蛋白，該系統(tǒng)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)：酵母能高密度連續(xù)培養(yǎng)；外源基因整合到酵母染色體中能穩(wěn)定遺傳，不易丟失；具有強(qiáng)啟動(dòng)子可誘導(dǎo)高效表達(dá)；表達(dá)的蛋白分泌到胞外，易于純化；具有真核蛋白所具有的后加工過程，尤其是糖基化修飾等；已有多種蛋白在該系統(tǒng)成功表達(dá)[10-11]。

我們按照酵母密碼子的偏愛性優(yōu)化了植物甜蛋白中des-pGlu1-Brazzein的密碼子，構(gòu)建了適合在甲醇酵母中組表達(dá)的載體，并成功實(shí)現(xiàn)了des-pGlu1-Brazzein在甲醇酵母中的表達(dá)。所表達(dá)的甜蛋白分泌到上清中，約占上清蛋白的51.6%左右，其他雜蛋白相對(duì)較少，基于以前研究的結(jié)果，des-pGlu1-Brazzein耐熱，所以在純化分離時(shí)我們采用熱處理的方法純化目的蛋白，這種方法簡(jiǎn)便快捷，純化效果好，很適合大規(guī)模純化。

表達(dá)的目的蛋白的分子量約為9 kDa，比預(yù)計(jì)的分子量大。這可能是因?yàn)樗磉_(dá)的肽鏈上的某些氨基酸殘基被糖基修飾[11]。我們采用生物軟件分析表達(dá)的蛋白上有一些 0-糖基修飾位點(diǎn)，這還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

所表達(dá)的目的蛋白純化后經(jīng)多人品嘗，具有一定的甜度，約為蔗糖甜度的200倍，比報(bào)道的甜度低，其原因可能與其分子量增加有關(guān)，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；這可能與品嘗的測(cè)定的方式具有較大的主觀性有關(guān)，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果可能有較大的誤差，還需要進(jìn)一步分析。

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Optimization of plant des-pGlu1-Brazzein gene according to yeasty biased codons and its expression in Pichia pastoris

Chunli Li, Lu Han, Zhenyu Zheng, and Weidong Zhao
College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

According to the amino acid sequence of des-pGlu1-Brazzein, 4 pairs of oligonucleotide with cosmic site were synthesized by using yeasty biased codons. After linkage and PCR, the 179 bp code area of des-pGlu1-Brazzein was obtained and inserted into pPIC9K, which resulted in the recombinant expression vector pPIC9K-Bra. By digestion with Sal I, the lined pPIC9K-Bra was transformed into Pichia pastoris GS115 by electric shock. The results of expression indicted that the secreted target protein accounted for 51.6% of total protein in the supernatant and showed biological activity after purification.

des-pGlu1-Brazzein, Pichia pastoris, expression, biological activity

甜蛋白是從熱帶植物中提取的一類蛋白，其甜度高，熱量低；甜味純正，口感好；食用該類蛋白不會(huì)使體內(nèi)血糖升高，不會(huì)引起口腔蛀牙，無毒副作用。目前發(fā)現(xiàn)的甜蛋白有7種，其中Brazzein (巴西甜) 是Ming和Hellekant從西非植物Pentadiplandra brazzeana Baillion的果實(shí)中分離得到的一種甜度極高的蛋白[1]，它有一種異構(gòu)體，由53個(gè)氨基酸組成(僅僅缺乏第一個(gè)氨基酸，稱為des-pGlu1-Brazzein)，其甜度更高，是Brazzein的2倍，以分子量為基礎(chǔ)進(jìn)行比較，其甜度是蔗糖甜度的 4 000倍，以重量為基礎(chǔ)進(jìn)行比較，其甜度是蔗糖甜度的1 000倍[2-3]。是目前為止所發(fā)現(xiàn)甜蛋白中甜度最高、分子量最小、水溶性最好的蛋白，是一種具有廣闊開發(fā)前景的甜蛋白。

December 2, 2010; Accepted: March 24, 2011

Supported by:Basic Research Foundation from the Education Department of Henan Province (No. 2004922043), Doctor Foundation of Henan Agricultural University.

Chunli li. Tel/Fax: +86-371-63558180; E-mail: hnclli@163.com

河南省教育廳基礎(chǔ)研究項(xiàng)目 (No. 2004922043)，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士基金項(xiàng)目資助。