楊鵬翔，王曦晨，王宇祥，王啟貴，李輝

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030

隨著人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)類蛋白、醫(yī)用類蛋白需求量的日益增長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究越來(lái)越多地集中在建立更為經(jīng)濟(jì)高效的生產(chǎn)技術(shù)平臺(tái)上[1]。最初，哺乳動(dòng)物的乳腺被認(rèn)為是一個(gè)很有希望的生物反應(yīng)器，應(yīng)用羊乳汁生產(chǎn)的治療人類血凝疾病的轉(zhuǎn)基因藥物于2006年成功上市，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了道路[2]。但家畜因世隔長(zhǎng)、擴(kuò)群慢、飼料成本高，從乳中純化外源蛋白工藝復(fù)雜等劣勢(shì)，使其成為一種低效過(guò)程。相比之下，禽類具有個(gè)體小、產(chǎn)蛋多、蛋白提取技術(shù)成熟，且所產(chǎn)生的蛋白具有與人類近似的糖基化結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，使得轉(zhuǎn)基因雞輸卵管生物反應(yīng)器的研究成為最具有競(jìng)爭(zhēng)力的前沿產(chǎn)業(yè)之一[3]。

目前，構(gòu)建用于攜帶外源基因的高效表達(dá)載體和良好的導(dǎo)入方法是禽類轉(zhuǎn)基因研究的兩大關(guān)鍵技術(shù)[4]。因此，篩選出高效的外源基因表達(dá)載體是禽類轉(zhuǎn)基因能否獲得成功的首要條件。雞輸卵管的管狀腺細(xì)胞具有表達(dá)和分泌卵白蛋白的強(qiáng)大功能和高度特異性，其中，卵清蛋白 (Ovalbumin，OV) 占白蛋白的 55%~60%，表明該基因啟動(dòng)調(diào)控區(qū)的高度有效性，許多研究者因此選擇該基因 5'調(diào)控序列作為制備雞輸卵管生物反應(yīng)器的首選調(diào)控元件[5]。宇麗等的研究中，采用OV基因5′端1.2 kb調(diào)控序列，實(shí)現(xiàn)了組織特異性表達(dá)[6]。然而，Zhu等分別用OV基因5′側(cè)翼7.5 kb和15 kb片段構(gòu)建的表達(dá)載體卻未能成功實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)[7]。最近，逆轉(zhuǎn)錄病毒其中一族的慢病毒載體因具有能夠感染分裂期和靜止細(xì)胞、主動(dòng)整合到基因組、導(dǎo)入的外源基因不易沉默、能夠穩(wěn)定地進(jìn)行種系間傳遞等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用來(lái)制備轉(zhuǎn)基因雞[8]。McGrew等認(rèn)為利用慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因雞，在表達(dá)效率上比目前所報(bào)道的任何其他載體高出百倍[9]，因此被認(rèn)為是最有希望的禽類轉(zhuǎn)基因工具。

本研究克隆了雞卵清蛋白基因5′端1.25 kb調(diào)控序列，通過(guò)構(gòu)建雞卵清蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體、巨細(xì)胞病毒 (Cytomegalovirus，CMV) 啟動(dòng)子的對(duì)照質(zhì)粒載體和慢病毒載體，采用綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 和熒光素酶 (Luciferase，Luc) 兩種標(biāo)記基因，在雞原代輸卵管上皮細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞、鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞和牛乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，利用熒光顯微鏡觀察和酶活性統(tǒng)計(jì)分析載體的表達(dá)活性和細(xì)胞特異性，篩選出實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)的載體，期望為轉(zhuǎn)基因雞生物反應(yīng)器的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)、pEGFP-C1為本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體 pMD18-T購(gòu)自大連寶生物公司；熒光素酶報(bào)告基因載體 pGL3-Basic、pRL-TK購(gòu)自Promega公司；慢病毒顆粒購(gòu)自上海英為信公司。大腸桿菌JM109、DH5α感受態(tài)菌種均為本實(shí)驗(yàn)室保存；BamHⅠ、XhoⅠ等各種限制性內(nèi)切酶、Taq酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA marker均購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司。凝膠回收 (小量) 試劑盒、質(zhì)粒 (小量) 抽提試劑盒購(gòu)自AXYGEN生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。D-MEM/F-12培養(yǎng)基、D-MEM高糖培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶購(gòu)自Invitrogen公司；明膠、青霉素、鏈霉素、Triton X-100等購(gòu)自 Sigma公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；廣譜角蛋白抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司。56周齡產(chǎn)蛋母雞來(lái)自于本校畜牧園區(qū)雞飼養(yǎng)場(chǎng)；雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1由哈爾濱獸醫(yī)研究所 志高研究員饋贈(zèng)；鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；牛乳腺上皮細(xì)胞系由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心李慶章教授饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) OV基因序列 (GenBank Accession No. J00895) 設(shè)計(jì)引物OVNF、OVNR，用于擴(kuò)增OV調(diào)控區(qū)。上下游引物分別引入NruⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。片段長(zhǎng)度為1 238 bp；根據(jù)克隆載體pEGFP-C1基因序列 (GenBank Accession No. CVU55763) 設(shè)計(jì)引物GFPF、GFPR，用于擴(kuò)增綠色熒光蛋白基因。上下游引物分別引入 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切位點(diǎn)。片段長(zhǎng)度為725 bp；根據(jù)克隆載體pGL3-Basic基因序列 (GenBank Accession No. U47295) 設(shè)計(jì)引物L(fēng)ucF、LucR，用于擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶基因。上下游引物分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。片段長(zhǎng)度為1 677 bp。

1.2.2 pcDNA3.1(+) 載體的改造

根據(jù)載體圖譜分析，用限制性酶 PvuⅡ酶切pcDNA3.1(+) 載體，切除其中的neo基因，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA回收試劑盒回收3.2 kb片段，自體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，從陽(yáng)性的重組子中獲得不含 neo基因的改造載體pc[10]。用限制性酶NruⅠ和HindⅢ雙酶切載體pc，切除其中的CMV啟動(dòng)子，電泳回收，獲得大小為2.5 kb的載體框p。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.3 卵清蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

采用設(shè)計(jì)的引物OVNF和OVNR，以雞的基因組DNA為模板，采用高保真Taq DNA聚合酶擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NruⅠ和HindⅢ雙酶切回收后，連接到改造的表達(dá)載體 p中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)后，挑取光滑單菌落接種至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒 DNA，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增及酶切鑒定篩選轉(zhuǎn)化子，將初步判定陽(yáng)性的重組子菌種送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為pOV。

1.2.4 包含報(bào)告基因表達(dá)載體的構(gòu)建

采用設(shè)計(jì)的引物 GFPF和 GFPR、LucF和LucR，分別從 PEGFP-C1、PGL3-Basic中擴(kuò)增出EGFP、Luc基因序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切回收后分別連接到卵清蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體 pOV和真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(+) 中，以和1.2.3中相同的方法，將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆分別命名為pOV-EGFP、pOV-Luc、pcDNA3.1(+)-EGFP、pcDNA3.1(+)-Luc。

1.2.5 雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

將56周齡的產(chǎn)蛋母雞斷頸放血，腹部消毒，無(wú)菌取出輸卵管膨大部分。在膨大部切取3~5 cm的組織，放入裝有磷酸緩沖液 (Phosphate belance solution，PBS) 的平皿中，反復(fù)沖洗，盡量除去雞輸卵管上皮細(xì)胞分泌的卵清蛋白和其他粘液。用小鑷子小心摘取輸卵管內(nèi)壁的褶皺組織上皮，用眼科剪剪碎組織，隨即轉(zhuǎn)入含有Ⅰ型膠原酶消化液的試管中進(jìn)行初步消化，于37 ℃消化 60 min (每5 min振蕩1次)。消化完畢，將消化產(chǎn)物分裝入離心管，1 000 r/min離心10 min，除去培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)入含有胰酶消化液的試管中繼續(xù)消化，于37 ℃消化10 min (每2 min振蕩1次)。加入培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打，經(jīng)3層無(wú)菌紗布過(guò)濾。濾液以1 000 r/min離心10 min，除去培養(yǎng)液，用含 10%胎牛血清 (Fetal bovine serum，F(xiàn)BS) 的D-MEM-F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，即為純化前的雞輸卵管上皮細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液鋪瓶后每5 h進(jìn)行1次差速貼壁，過(guò)程為將懸液吸出，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用含10% FBS的D-MEM-F12培養(yǎng)液重懸，重新鋪到新瓶中。差速貼壁3次以后，即為純化的雞輸卵管上皮細(xì)胞[11]。將細(xì)胞記數(shù)后，按 5×105/孔(6孔板) 左右的密度接種，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次[12]。

1.2.6 雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的鑒定

每日對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，掌握輸卵管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和細(xì)胞形態(tài)的差異，待細(xì)胞貼壁且呈現(xiàn)出上皮細(xì)胞形態(tài)特征時(shí)，對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)鑒定。取普通潔凈的蓋玻片，接種細(xì)胞，制作輸卵管上皮細(xì)胞爬片。待細(xì)胞長(zhǎng)成80%匯合單層時(shí)，倒掉培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次。用冰浴的甲醇于 4 ℃固定 10 min。用含 0.1%的Triton X-100的PBS溶液 (PBSTx) 沖洗細(xì)胞3次，每次5 min，然后用干凈濾紙擦掉邊緣水分。用含5%牛血清白蛋白的PBSTx封閉60 min，用搖床輕輕搖動(dòng)。去封閉液，用 PBSTx稀釋的異硫氰酸熒光素 (Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 標(biāo)記角蛋白抗體作用60 min。去除抗體，用PBSTx沖洗細(xì)胞3次，每次5 min，然后用干凈濾紙擦掉邊緣水分，用抗熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察角蛋白的表達(dá)[13-14]。

1.2.7 雞胚成纖維細(xì)胞系、鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞系、牛乳腺上皮細(xì)胞系的復(fù)蘇和培養(yǎng)

將液氮保存的細(xì)胞放入37 ℃的水中，搖動(dòng)凍存管，直至融化。用70%酒精清潔凍存管外壁，加入到裝有37 ℃預(yù)溫的完全培養(yǎng)液的離心管中，針對(duì)各類型細(xì)胞，在離心管中加入不同濃度FBS的完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)：雞胚成纖維細(xì)胞采用含5% FBS的D-MEM-F12培養(yǎng)液；鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞采用含10% FBS的D-MEM高糖培養(yǎng)液；牛乳腺上皮細(xì)胞采用含20% FBS的D-MEM-F12培養(yǎng)液。溫和混勻，反復(fù)數(shù)次，1 000 r/min離心5 min后，棄去上清。收集細(xì)胞后，用各細(xì)胞的完全培養(yǎng)液重懸，進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，按5×105/孔 (6孔板) 左右的密度接種，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次。待細(xì)胞鋪滿時(shí)，即可傳代。

1.2.8 質(zhì)粒載體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種至6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 70%~80%匯合時(shí)，按FuGENE?HD Transfection Reagent (羅氏) 說(shuō)明書操作。將FuGENE?HD Transfction Reagent、DNA和培養(yǎng)液調(diào)整到 15 ℃~25 ℃，振蕩混勻。將含有 GFP報(bào)告基因的重組質(zhì)粒用無(wú)血清無(wú)雙抗的 DMEM稀釋質(zhì)粒至0.02 g/L；將含有Luc報(bào)告基因的重組質(zhì)粒分別與phRL-TK質(zhì)粒按質(zhì)量比1∶20進(jìn)行混合后，用無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM稀釋質(zhì)粒至0.02 g/L。吸取5 μL的HD加入到100 μL含質(zhì)粒的培養(yǎng)液中，將混合物用槍吹打15次，室溫孵育15 min。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染混合物加到液面以下，搖晃培養(yǎng)板混勻，48 h后觀察結(jié)果。

1.2.9 病毒顆粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種至6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50%~70%匯合時(shí)，按照上海英為信公司慢病毒使用說(shuō)明書操作。根據(jù)MOI值將計(jì)算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)液中，與體積比 1∶20的phRL-TK質(zhì)粒進(jìn)行混合，加入聚凝胺至終濃度為6~8 mg/L，將混合物用槍吹打15次。棄掉細(xì)胞原培養(yǎng)液，將含有慢病毒的混合物加到培養(yǎng)板中，搖晃混勻，轉(zhuǎn)染后12 h更換成正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，96 h后觀察結(jié)果。

1.2.10 報(bào)告基因的檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48或96 h后，將轉(zhuǎn)染EGFP報(bào)告基因的細(xì)胞于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；將轉(zhuǎn)染 Luc報(bào)告基因的細(xì)胞按照Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞。每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)，取樣品20 μL，加入100 μL Luciferase檢測(cè)試劑，用移液器吹打 15次后測(cè)定Luciferase值。完成后，加入100 μL Renilla檢測(cè)試劑，用移液器吹打15次后測(cè)定Renilla值。

2 結(jié)果

2.1 載體構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見一條約 1.25 kb大小的單一條帶，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增的OV調(diào)控區(qū)大小相符 (圖1)。將該產(chǎn)物回收后連接入pMD18-T Simple中進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，克隆的片段與 NCBI報(bào)道的相比只有兩個(gè)堿基的差別。分別是上游422位的堿基由G變成C，上游667位的堿基由T變成了C，都沒(méi)有發(fā)生在已報(bào)道的調(diào)控區(qū)的關(guān)鍵調(diào)控元件部位。

圖1 雞卵清蛋白調(diào)控區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR products of chicken OV regulatory region. M: DL2000 marker; 1?3: PCR products.

將擴(kuò)增的 O V調(diào)控區(qū)片段克隆入改造的pcDNA3.1(+) 載體，獲得雞卵清蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體pOV。再將重組載體pOV和pcDNA3.1(+) 分別連入EGFP、Luc報(bào)告基因片段，獲得帶有標(biāo)記基因的雞卵清蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體 pOV-EGFP、pOV-Luc和 CMV啟動(dòng)子表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)-EGFP和pcDNA3.1(+)-Luc。為了驗(yàn)證所構(gòu)建載體的正確性，用限制性內(nèi)切酶NruⅠ/HindⅢ和BamHⅠ/ XhoⅠ分別雙酶切載體，經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)，結(jié)果切出的 OV調(diào)控區(qū)的大小約為 1.25 kb，酶切的EGFP、Luc報(bào)告基因片段大小分別約為725 bp、1 677 bp，片段長(zhǎng)度與預(yù)計(jì)大小相一致，表明連接正確 (圖2~5)。

圖2 pOV-EGFP載體的酶切鑒定Fig. 2 Identification of pOV-EGFP by enzyme digestion. M: DL5000 marker; 1: pOV-EGFP vector digested with Nru Ⅰand Hind Ⅲ; 2: pOV-EGFP vector digested with BamH Ⅰand Xho Ⅰ.

圖3 pOV-Luc載體的酶切鑒定Fig. 3 Identification of pOV-Luc by enzyme digestion. M: DL5000 marker; 1: pOV-Luc vector digested with Nru Ⅰand Hind Ⅲ ; 2: pOV-Luc vector digested with BamH Ⅰand Xho Ⅰ.

圖4 pcDNA3.1(+)-EGFP的酶切鑒定Fig. 4 Identification of pcDNA3.1(+)-EGFP by enzyme digestion. M: DL2000 marker; 1?2: pcDNA3.1(+)-EGFP vector digested with BamH Ⅰand Xho Ⅰ.

2.2 卵清蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體和對(duì)照載體啟動(dòng)子活性比較

將CMV啟動(dòng)子表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-EGFP、雞卵清蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體pOV-EGFP分別轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞、雞原代輸卵管上皮細(xì)胞、鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞和牛乳腺上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)效果。進(jìn)行 3次以上重復(fù)，都選取實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果中 EGFP表達(dá)量較高、熒光分布均勻的圖片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后 pcDNA3.1(+)-EGFP和pOV-EGFP在4種細(xì)胞中均有熒光表達(dá) (圖6)。 pcDNA3.1(+)-EGFP在轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞組中熒光表達(dá)量較高，在其他 3種細(xì)胞組中表達(dá)水平相當(dāng)(圖6E~H)；pOV-EGFP在轉(zhuǎn)染鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞組中熒光表達(dá)量較低，在其他3種細(xì)胞組中表達(dá)水平相當(dāng) (圖6I~L)?？傮w來(lái)看，pcDNA3.1(+)-EGFP在轉(zhuǎn)染的 4種細(xì)胞組中熒光表達(dá)量明顯高于pOV-EGFP。

圖5 pcDNA3.1(+)-Luc的酶切鑒定結(jié)果Fig. 5 Identification of pcDNA3.1(+)-Luc by enzyme digestion. M: DL2000 marker; 1?2: pcDNA3.1(+)-Luc vector digested with BamH Ⅰand Xho Ⅰ.

圖6 pcDNA3.1(+)-EGFP、pOV-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后EGFP表達(dá)效果Fig. 6 Expression of EGFP after transfected cells with pcDNA3.1(+)-EGFP and pOV-EGFP. (A,E,I) Chicken embryo fibroblasts cells. (B,F,J) Chicken oviduct epithelial cells. (C,G,K) Mouse 3T3-L1 preadipocytes cells. (D,H,L) Bovine mammary epithelial cells. (A-D) Cells picture. (E-H) Transfected with pcDNA3.1(+)-EGFP. (I-L) Transfected with pOV-EGFP.

將載體 pcDNA3.1(+)-Luc和 pOV-Luc分別與phRL-TK共轉(zhuǎn)染以上4種細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染后48 h檢測(cè)螢火蟲熒光素酶表達(dá)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后pcDNA3.1(+)-Luc和pOV-Luc在4種細(xì)胞中均有熒光素酶的表達(dá)。pcDNA3.1(+)-Luc在轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞組中酶表達(dá)量較高，較其他3組差異極顯著(P＜0.01)，pOV-Luc在轉(zhuǎn)染雞原代輸卵管上皮細(xì)胞組酶表達(dá)量略高于其他組，較鼠 3T3-L1前脂肪細(xì)胞組和牛乳腺上皮細(xì)胞組差異顯著 (P＜0.05)，較雞胚成纖維細(xì)胞組差異不顯著(P＞0.05)。總體來(lái)看，pcDNA3.1(+)-Luc在轉(zhuǎn)染4種細(xì)胞組中的酶表達(dá)量都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出pOV-Luc，在雞胚成纖維細(xì)胞組高達(dá)6 000多倍，在雞輸卵管上皮細(xì)胞組也有473倍 (圖7)。

2.3 慢病毒載體介導(dǎo)基因在不同細(xì)胞中的表達(dá)

將慢病毒 LV-GFP-Luc分別感染雞胚成纖維細(xì)胞、雞原代輸卵管上皮細(xì)胞、鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞和牛乳腺上皮細(xì)胞，感染后96 h檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)效果。進(jìn)行 3次以上重復(fù)，都選取實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果中 EGFP表達(dá)量較高、熒光分布均勻的圖片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢病毒載體具有良好的宿主廣泛性，感染后LV-GFP-Luc在4種細(xì)胞中均有熒光表達(dá)，但慢病毒表達(dá)效率在不同的細(xì)胞間具有差異性，在感染雞胚成纖維細(xì)胞組中熒光表達(dá)量略高，在其他3種細(xì)胞組中表達(dá)水平相當(dāng) (圖8)。

圖7 pcDNA3.1(+)-Luc、pOV-Luc轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光素酶的表達(dá) (螢火蟲/海腎)Fig. 7 Expression of Luciferase after transfected cells with pcDNA3.1(+)-EGFP and pOV-EGFP (Firefly/Renilla). RLU: relative light unit. 1: chicken embryo fibroblasts cells; 2: chicken oviduct epithelial cells; 3: mouse 3T3 preadipocytes cells; 4: bovine mammary epithelial cells. Capital-small letter means highly differ significantly (capital letter for cells transfected with pcDNA3.1(+)-Luc and small letter for cells transfected with pOV-Luc, P<0.01); A-B means highly differ significantly (P<0.01); a-b means differ significantly (P<0.05).

慢病毒LV-GFP-Luc感染后96 h檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感染后在 4種細(xì)胞中均有熒光素酶的表達(dá)，其中，在感染雞胚成纖維細(xì)胞組中酶表達(dá)量較高，較其他3組差異極顯著 (P＜0.01) (圖9)。

圖8 慢病毒感染細(xì)胞后綠色熒光蛋白的表達(dá)效果Fig. 8 Expression of EGFP after infected cells with lentivial. (A) Chicken embryo fibroblasts cells. (B) Chicken oviduct epithelial cells. (C) Mouse 3T3 preadipocytes cells. (D) Bovine mammary epithelial cells.

圖9 慢病毒感染細(xì)胞后熒光素酶的表達(dá) (螢火蟲/海腎)Fig. 9 Expression of luciferase after infected cells with lentivial (Firefly/Renilla). RLU: relative light unit. 1: chicken embryo fibroblasts cells; 2: chicken oviduct epithelial cells; 3: mouse 3T3 preadipocytes cells; 4: bovine mammary epithelial cells. A-B means highly differ significantly (P<0.01).

2.4 慢病毒載體啟動(dòng)活性分析

在培養(yǎng)6~8 d的雞原代輸卵管上皮細(xì)胞中感染慢病毒LV-GFP-Luc，分別將感染單個(gè)細(xì)胞的病毒顆粒 (Multiplicity of infection，MOI) 設(shè)為5、10、20三個(gè)對(duì)照組，感染后96 h檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)效果。進(jìn)行 3次以上重復(fù)，都選取實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果中EGFP表達(dá)量較高、熒光分布均勻的圖片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著MOI的提高，綠色熒光蛋白表達(dá)量也隨之升高(圖10 A~C)，與之前2.2中結(jié)果相比，當(dāng)MOI為20時(shí)，LV-GFP-Luc感染雞原代輸卵管上皮細(xì)胞后熒光的表達(dá)量達(dá)到了 pcDNA3.1(+)-EGFP轉(zhuǎn)染該細(xì)胞的表達(dá)水平 (圖10D)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pOV-EGFP轉(zhuǎn)染該細(xì)胞的表達(dá)水平 (圖10E)。

3 討論

制備轉(zhuǎn)基因雞輸卵管生物反應(yīng)器的基本方法是以組織特異性基因的調(diào)控序列指導(dǎo)外源基因在雞輸卵管中定位表達(dá)，然后從轉(zhuǎn)基因雞所產(chǎn)的蛋中獲取表達(dá)產(chǎn)物[3,5]。雞卵清蛋白基因啟動(dòng)子是指導(dǎo)外源基因高效表達(dá)的理想調(diào)控區(qū)，該基因的一些與輸卵管特異性表達(dá)相關(guān)的調(diào)控元件已經(jīng)被廣泛研究，其中，類固醇依賴的正調(diào)控序列 (SDRE) 及其下游的負(fù)調(diào)控序列 (NRE) 和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游處的 TATATAT框是最為重要的調(diào)控元件[15]。Sanders等[16-17]的研究結(jié)果表明，這些元件都位于上游調(diào)控區(qū)1 kb以內(nèi)，說(shuō)明該長(zhǎng)度序列足以指導(dǎo)外源基因的高水平表達(dá)。Zhu等[7]分別用卵清蛋白基因 5′側(cè)翼7.5 kb和15 kb片段以及3′側(cè)翼15.5 kb片段作為雞輸卵管組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子，以抗腫瘤的單克隆抗體和人干擾素基因?yàn)槟康幕颍谱鞒龅霓D(zhuǎn)基因嵌合體家雞所產(chǎn)的雞蛋蛋清中外源蛋白的含量達(dá)到了3 mg，不過(guò)，未能實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)，推斷可能所采用的調(diào)控序列還不足以實(shí)現(xiàn)輸卵管組織特異性表達(dá)。Kwon等[18]縮短啟動(dòng)子長(zhǎng)度至1.35 kb用于轉(zhuǎn)基因鵪鶉，雖然在卵白中表達(dá)重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗蛋白含量?jī)H為88.7~233.8 pg?L，但卻保持了輸卵管的組織特異性。

圖10 雞輸卵管上皮細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)效果Fig. 10 Expression of EGFP in chicken oviduct epithelial cells. (A?C) Infected with lentivial (A: MOI=20, B: MOI=10, C: MOI=5). (D) Transfected with pcDNA3.1(+)-EGFP. (E) Transfected with pOV-EGFP. (F) Blank control.

本研究中，對(duì)照載體的CMV啟動(dòng)子是廣泛性表達(dá)的啟動(dòng)子，因此，pcDNA3.1(+)-GFP和pcDNA3.1(+)-Luc在轉(zhuǎn)染的4種細(xì)胞中都獲得了表達(dá)。在雞胚成纖維細(xì)胞組綠色熒光蛋白和熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)量都要明顯高于其他組，可能與成纖維細(xì)胞快速的生長(zhǎng)特性和對(duì)質(zhì)粒載體的表達(dá)高效性有關(guān)。

在選用1.25 kb雞卵清蛋白基因5′側(cè)翼區(qū)為啟動(dòng)子的載體轉(zhuǎn)染中，pOV-EGFP和pOV-Luc在4種細(xì)胞中也都獲得了表達(dá)，沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞特異性，可能是所采用的調(diào)控序列沒(méi)有包含所有必要的調(diào)控元件，還不能實(shí)現(xiàn)輸卵管組織特異性表達(dá)。轉(zhuǎn)染pOV-EGFP在鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞組綠色熒光蛋白表達(dá)量較低；轉(zhuǎn)染pOV-Luc在雞原代輸卵管上皮細(xì)胞組熒光素酶的表達(dá)量與雞胚成纖維細(xì)胞組表達(dá)量差異不顯著，與鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞組和牛乳腺上皮細(xì)胞組差異顯著，這些都可能與所構(gòu)建的載體在不同細(xì)胞中的表達(dá)差異有關(guān)。同時(shí)，卵清蛋白啟動(dòng)子載體在轉(zhuǎn)染各細(xì)胞組中報(bào)告基因表達(dá)活性較低，與 CMV啟動(dòng)子的對(duì)照質(zhì)粒載體的表達(dá)效率相差數(shù)百倍，這與之前孫明軍等[19]所得的結(jié)果相一致，可能是與擴(kuò)增的卵清蛋白基因調(diào)控區(qū)片段沒(méi)有包含其遠(yuǎn)端的增強(qiáng)子有關(guān)[5]。

近年來(lái)，應(yīng)用慢病毒作為表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因雞輸卵管反應(yīng)器方面的研究已經(jīng)獲得了初步成功，在多種細(xì)胞和組織中檢測(cè)到了外源基因的表達(dá)。Xu等[20]以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白為標(biāo)記基因構(gòu)建復(fù)制缺陷型慢病毒載體感染不同來(lái)源、不同分化特征的細(xì)胞，均獲得了較高水平的表達(dá)。Park等[21]通過(guò)慢病毒載體結(jié)合顯微注射和原始生殖細(xì)胞等轉(zhuǎn)基因方法，生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因雞在多種組織中都檢測(cè)到了標(biāo)記基因的表達(dá)。特別是最近Masamichi等[22]應(yīng)用廣泛表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)的藥用抗體在轉(zhuǎn)基因雞的血清，所產(chǎn)蛋的蛋黃和蛋白中都獲得了表達(dá)。本研究中，慢病毒在所感染的 4種細(xì)胞 (分別來(lái)源于雞、鼠、牛) 都獲得了綠色熒光蛋白的表達(dá)，表明其具有廣泛的宿主。但在不同的細(xì)胞間表達(dá)效率具有一定的差異。在雞胚成纖維細(xì)胞組綠色熒光蛋白的表達(dá)量略高于其他 3個(gè)細(xì)胞組，熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)細(xì)胞組，可能與該細(xì)胞所具有的增殖能力強(qiáng)，對(duì)病毒耐受性好，長(zhǎng)期保持性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)[23]有關(guān)。同時(shí)，兩種報(bào)告基因所得結(jié)果的差異可能與不同報(bào)告基因的檢測(cè)方法有關(guān)。目前，獲取輸卵管高效特異性啟動(dòng)子，并與慢病毒表達(dá)載體相結(jié)合將成為轉(zhuǎn)基因雞輸卵管反應(yīng)器研究的熱點(diǎn)。

獲得外源基因在雞輸卵管組織高效表達(dá)的載體是制備雞輸卵管生物反應(yīng)器的首要條件。Ochiai等[24]采用卵清蛋白基因5′側(cè)翼1.35 kb片段和3種不同的病毒啟動(dòng)子分別構(gòu)建載體，通過(guò)基因槍的方法注射到產(chǎn)蛋母雞的輸卵管部位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卵清蛋白調(diào)控區(qū)。本研究中，采用不同 MOI的慢病毒感染雞原代輸卵管上皮細(xì)胞，隨著MOI的提高，GFP表達(dá)量升高。在MOI為20時(shí)熒光表達(dá)活性就可達(dá)到攜帶CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于攜帶雞卵清蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)載體水平，與Ochiai等所得的結(jié)果一致。綜合來(lái)看，與雞卵清蛋白啟動(dòng)子表達(dá)載體相比，慢病毒載體的轉(zhuǎn)基因效率較高，在轉(zhuǎn)基因雞輸卵管反應(yīng)器的制備上具有較好的應(yīng)用前景。

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