陳飛雄申林娜蒲 軍徐 蔚

（1 昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650101；2 昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650101）

線粒體DNA編碼蛋白質(zhì)亞基的研究

陳飛雄1申林娜2蒲 軍1徐 蔚1

（1 昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650101；2 昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650101）

人類線粒體DNA（mtDNA）是全長為16569 bp的雙鏈閉環(huán)分子，除負(fù)責(zé)編碼2種rRNA和22種tRNA外，還參與了4種呼吸酶復(fù)合物（13種多肽）的形成。包括NADH-CoQ還原酶（NADH-CoQ reductase，ND）中的7個亞基（ND1-6，4L）；泛醌-細(xì)胞色素C還原酶（CoQ-Cytc reductase）的1個亞基（Cyt-b）；細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome Coxidase,COX）中的3個亞基（COX I–III）；ATP合成酶（ATPase）中的2個亞基（ATPase6，8）。本文就人線粒體DNA編碼的各蛋白亞基的結(jié)構(gòu)、功能和研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

線粒體基因組；線粒體；NADH-CoQ還原酶；泛醌-細(xì)胞色素C還原酶；細(xì)胞色素C氧化酶；ATP合成酶

線粒體是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞器，除了紅細(xì)胞外人類所有體細(xì)胞都含有線粒體，其中多數(shù)細(xì)胞含有數(shù)以萬計的線粒體。線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換體系和供能中心，它含有自己的DNA。就人體來說，線粒體內(nèi)的DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是核外惟一具有自己的遺傳密碼和蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)，控制著線粒體一些基本性質(zhì)。因此，線粒體除了能量轉(zhuǎn)換作用，還參與了4種呼吸酶復(fù)合物（13種多肽）的形成。包括NADH-CoQ還原酶（NADH CoQ reductase，ND）、泛醌-細(xì)胞色素C還原酶（CoQ-Cytc reductase）、細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome Coxidase，COX）和ATP合成酶（ATPase）[1,2]。

1 線粒體基因組的構(gòu)成

人類每個mtDNA約有10個基因拷貝，每個細(xì)胞包含103～104個線粒體。mtDNA是存在于線粒體內(nèi)的雙鏈閉環(huán)分子，由16569bp組成，雙鏈中一條為重鏈（H），一條為輕鏈（L）。這是根據(jù)它們的基因產(chǎn)物在CsCl中的密度的不同而區(qū)分的，兩條鏈均具有編碼功能。它除了有DNA外，還有自己的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，因為它有22個tRNA基因和2個rRNA基因以及核糖體等。mtDNA蛋白質(zhì)編碼基因的12/13是由mtDNA的重鏈轉(zhuǎn)錄的，所編碼的13個蛋白質(zhì)為：細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞基，NADH脫氫酶的ND1-6和ND4L亞基，細(xì)胞色素b以及ATP酶6、8亞基[2]。其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的起始點位于D-loop區(qū)（16028～577np）。mtDNA轉(zhuǎn)錄與nDNA不同步，其64個密碼子中有4個與核基因組不同[3,4]。在mtDNA，除了一小段D環(huán)區(qū)域外，其他序列無內(nèi)含子，因此任何mtDNA的突變都會影響到其基因組內(nèi)的重要功能區(qū)域，從而影響線粒體功能。

2 mtDNA編碼的蛋白質(zhì)亞基的結(jié)構(gòu)與功能

2.1 mtDNA編碼ATP合酶亞基

mtDNA編碼ATP合酶亞基的是F0亞基中的ATPase6和ATPase8。ATPase6基因存在于所有生物中，但是細(xì)菌、植物的線粒體基因組不包含ATPase8基因，這與一般后生動物有所不同。在人的線粒體基因中，ATPase6和ATPase8 2個基因相鄰并重疊45bp，ATPase8基因長207bp，編碼68個氨基酸；ATPase6基因長681bp，編碼226個氨基酸[5-8]。

mtDNA ATPase8和ATPase6是調(diào)控能量合成的重要基因，mtDNA ATPase8和ATPase6表達(dá)異常會導(dǎo)致線粒體能量合成障礙進(jìn)而加速細(xì)胞凋亡。柏干榮等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在失血性休克腸上皮細(xì)胞mtDNA的ATPase6基因測序研究中發(fā)現(xiàn)缺血缺氧時存在堿基突變及編碼氨基酸的改變，進(jìn)而影響F1F0-ATPase蛋白的功能和ATP的合成。李瑋等[6]通過研究發(fā)現(xiàn)腦出血后血腫周圍水腫組織線粒體ATPase-6基因表達(dá)開始下降，至第7d時ATPase6基因表達(dá)明顯下降，這一結(jié)果提示腦出血可有足夠能量供應(yīng)促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。張瑩等[7]研究發(fā)現(xiàn)，長時間的缺血缺氧使mtDNA的ATPase6、ATPase8編碼基因改變，繼之其轉(zhuǎn)錄下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化缺陷并加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生。ATPase6基因位于8993位點的核酸突變會引起神經(jīng)病學(xué)性肌無力、運動失調(diào)和色素性視網(wǎng)膜炎綜合[8]。洪燈等[9,10]通過研究成功構(gòu)建了pG-PH1/GFP/ Neomouse-shATP8 RNA干擾質(zhì)粒，為下一步進(jìn)行ATP ase8基因RNA干擾在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟中的作用奠定基礎(chǔ)。并用RT-PCR檢測GV期單個卵母細(xì)胞中ATPase8基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)小鼠GV期卵母細(xì)胞特異表達(dá)的ATPase8基因可能與卵母細(xì)胞的正常發(fā)育成熟相關(guān)。

2.2 mtDNA編碼的細(xì)胞色素氧化酶亞基

COXⅠ亞基、COXⅡ亞基、COXⅢ亞基由mtDNA編碼。其中COXⅠ亞基基因總長約1542bp，編碼513個氨基酸，與血紅素a1、血紅素a3和CuB結(jié)合；COXⅡ亞基基因總長約684bp，編碼227個氨基酸，與CuA結(jié)合，位于線粒體胞質(zhì)面與細(xì)胞色素C進(jìn)行反應(yīng)[11]；COXⅢ亞基基因總長約781bp，編碼260個氨基酸，參與氧化還原連接的質(zhì)子易位過程，起調(diào)節(jié)作用。COXⅠ為mtDNA編碼的3個亞基中最大的一個，與COXⅡ一起構(gòu)成細(xì)胞色素氧化酶的活性中心[12]。

在不同的組織線粒體COX的活性存在著很大差異，按活性大小排列依次是心臟、肝、腎和腦組織等。近年來有報道，心臟和腦缺血缺氧后會表現(xiàn)相應(yīng)區(qū)域COX活性下降，COX表達(dá)改變。Abe等[13]報道，在短暫缺血最敏感的CAl區(qū)缺血3min后再灌，沙鼠該區(qū)的COX在3h出現(xiàn)下降，8h時更明顯，且進(jìn)行性加重。提示C0X活性的下降可能是細(xì)胞能量代謝障礙的重要原因。顧衛(wèi)東等[14]研究發(fā)現(xiàn)，低溫可通過保護(hù)C0X活性減輕腦缺血/再灌注期間的細(xì)胞能量代謝障礙，從而減少延遲性神經(jīng)元死亡（DND）。

Wang等[15]認(rèn)為，正常細(xì)胞mtDNA的轉(zhuǎn)錄水平降低、細(xì)胞凋亡增高，使得細(xì)胞程序性死亡，而mtRNA的增高可降低細(xì)胞凋亡，可能與細(xì)胞的癌變有關(guān)。并且Lu等[16]指出不同的腫瘤可能出現(xiàn)mtDNA不同的基因表達(dá)的改變。Parrella等[17]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者COXⅡ的表達(dá)比正常組織明顯增高。韓波等[18]應(yīng)用RT- PCR方法發(fā)現(xiàn)胃癌組織線粒體COXⅠ和ND4的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于遠(yuǎn)癌正常胃黏膜組織。癌變組織線粒體COXⅠ和COXⅡ的增高可能是腫瘤細(xì)胞為滿足自身能量需求的一種適應(yīng)性反應(yīng)，線粒體可能通過凋亡途徑參與腫瘤形成的過程。

高靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)COXⅢ在癲癇急性期表達(dá)顯著升高，靜止期降至對照水平，而慢性期則顯著降低。說明急性癇性發(fā)作誘發(fā)該亞單位的重新合成，而慢性期長期自發(fā)性孤立的發(fā)作則不足以誘導(dǎo)該亞單位的重新合成，反而破壞其合成機(jī)制；并發(fā)現(xiàn)COXⅢ基因和蛋白的改變與海馬神經(jīng)元丟失所導(dǎo)致的線粒體含量下降是無關(guān)的，可能的機(jī)制是活性氧簇機(jī)制。

2.3 mtDNA編碼的泛醌-細(xì)胞色素C還原酶亞基

細(xì)胞色素b（Cyt-b）是mtDNA編碼的蛋白質(zhì)。Cyt-b是一個橫貫?zāi)蓚?cè)的極端疏水性的蛋白，并與內(nèi)膜結(jié)合，含兩個血紅素b562/bH和b566/bL。Cyt-b基因序列全長為1135bp，編碼378 個氨基酸和一個終止密碼子。 對Cyt-b氨基酸組成和結(jié)構(gòu)基因的DNA順序研究指出，約68%的氨基酸為非極性的。對Cyt-b在電子傳遞鏈中的復(fù)雜功能至今還不清楚。

研究家兔在單純皰疹病毒感染的潛伏期神經(jīng)系統(tǒng)中基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Cyt-b的編碼基因下調(diào)表達(dá)[20]。Cyt-b在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中呈高表達(dá)[21]。郭麗君等[22]用PCR法擴(kuò)增、熒光DNA測序，發(fā)現(xiàn)糖尿病組線粒體Cyt-b基因持有多數(shù)的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）是有害的。張默函等[23]研究發(fā)現(xiàn)mtDNA Cyt-b的mRNA表達(dá)水平在乳腺癌組織較癌旁組織高，mtDNA Cyt-b基因在乳腺癌組織中轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，可能是腫瘤細(xì)胞為滿足自身能量需求的一種適應(yīng)性反應(yīng)，但是具體機(jī)制尚不清楚，尚有待進(jìn)一步研究。

由于Cyt-b基因在線粒體基因組中進(jìn)化速度適中，而且在一定的進(jìn)化尺度內(nèi)Cyt-b基因不受飽和效應(yīng)的嚴(yán)重影響，所提供的系統(tǒng)發(fā)育信息和遺傳分化水平適于分析種間和屬間差異。所以Cyt-b成為研究種內(nèi)或近緣種間系統(tǒng)發(fā)育和遺傳問題最常用的工具之一，它的部分或全序列被廣泛應(yīng)用于動物類群的系統(tǒng)進(jìn)化和分類研究中。付小全等[24]發(fā)現(xiàn)萍鄉(xiāng)肉紅鯽與其他鯽魚類的Cyt-b基因具有較高的同源性，與普通鯽魚的相似性為98%，萍鄉(xiāng)肉紅鯽與普通鯽魚親緣關(guān)系最近。

2.4 mtDNA編碼的NADH還原酶亞基

NADH還原酶疏水部分的7個亞基ND1-ND6和ND4L由mtDNA編碼[25]。在人的線粒體基因中，ND1基因長957bp，編碼318個氨基酸；ND2基因長1042bp，編碼347個氨基酸；ND3基因長346bp，編碼115個氨基酸；ND4基因長1378bp，編碼459個氨基酸；ND4L基因長297bp，編碼98個氨基酸；ND5基因長1812bp，編碼603個氨基酸；ND6基因長525bp，編碼174個氨基酸；其中ND4和ND4L 2個基因相鄰并重疊6bp。

李傳連等[26]對弱精子癥（AST）精子mtDNA ND3、ND4L基因突變檢測和分析時發(fā)現(xiàn)線粒體單體型與精子活力可能存在一定的相關(guān)性；mtDNA 10398G-10400T多態(tài)性可能是精子活力的有益因素，mtDNA G10310A突變可能是精子活力的有害因素。李明珍等[27]研究發(fā)現(xiàn)線粒體基因ND4 12026A→G突變攜帶者的家系臨床表現(xiàn)多樣，并可能與自身免疫相關(guān)。魏佳等[28]通過直接測序檢測乳腺癌、良性乳腺腫瘤散發(fā)病例外周血和乳腺組織中線粒體ND5基因變異，發(fā)現(xiàn)乳腺癌與良性乳腺腫瘤相比線粒體ND5基因更多的發(fā)生對線粒體功能產(chǎn)生影響的惡性突變，線粒體ND5基因突變與乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展可能存在一定相關(guān)，這種區(qū)別可能成為潛在的腫瘤診斷分子標(biāo)記。李東等[29]發(fā)現(xiàn)mtDNA3394T→C突變與老年線粒體糖尿病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，并起著重要作用。

3 展 望

近年來，隨著分子生物學(xué)、基因工程、克隆技術(shù)等技術(shù)手段的發(fā)展與完善，mtDNA結(jié)構(gòu)與功能的研究在分子進(jìn)化、生物分類、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系鑒定、法醫(yī)學(xué)鑒定、衰老、疾病診斷、細(xì)胞凋亡和氧化磷酸化作用機(jī)制等領(lǐng)域已經(jīng)取得了令人矚目的成就。在動物重要經(jīng)濟(jì)性狀的研究方面，比如在牛的肥育性狀、產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白含量、繁殖性狀等方面也已經(jīng)取得顯著的成績。在人類疾病研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的由mtDNA變異導(dǎo)致的疾病已達(dá)70多種，其中包括Parkinson綜合征、Alzheimer綜合征、Leber氏視神經(jīng)病（LHON）、老年癡呆與舞蹈綜合征（DEMCHO）、耳聾（DMDF）、癲癇（MERRF）等，因此，深入這一領(lǐng)域的研究，對于明確某些疾病的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療藥物和治療途徑及提高動物重要經(jīng)濟(jì)性狀等方面均有重要的意義。

[1]Inoue JG,Miya M,Tsukamoto K,et al.Complete mitochondrial DNA sequence of Conger myriaster (teleostei:Anguilliformes):novel gene order for vertebrate genomes andthe phylogenetic implications for anguilliform families[J].J Mol Evol,2001,52(4):311-320.

[2]Zedoni M,Gellera C,Antozzi C,et al.Maternally Inherited Myopathy:association with Mutationin Mirochondrial DNA tRNA[J].Lancet,1991,338(8760):143-147.

[3]Hochhauser D.Relevance of mitochondrial DNA in cancer[J].Lancet,2000,356(7):181-182.

[4]Yaron Y,Orr-Ortreger A.New genetic principles[J].Clin Obstet Gynecol,2002,45(3):593-604.

[5]柏干榮,陸松敏,武凡等.急性缺血缺氧大鼠腸上皮細(xì)胞線粒體ATPase6基因的表達(dá)研究[J].中國病理生理雜志,2001,17(11):1113.

[6]李瑋,周中和,王景周等.大鼠腦出血后血腫周圍組織線粒體ATPase-6基因表達(dá)及TUNEL陽性細(xì)胞動態(tài)變化研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2003,20(4):292-294.

[7]張瑩,別平,石承先等.冷保存時間對肝臟移植大鼠供肝線粒體ATPase6、ATPase8基因表達(dá)的影響及意義[J].山東醫(yī)藥,2008,48(35):4-5.

[8]張吉斌,劉月平,方美英等.線粒體ATP酶基因組成及生化機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國畜牧雜志,2010,7(1): 64-68.

[9]洪燈,宋緒華,符史干等.小鼠線粒體ATP8基因RNA干擾載體構(gòu)建[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,13(5):401-408.

[10]洪燈,宋緒華,符史干等.小鼠單個GV期卵母細(xì)胞中ATPS基因的表達(dá)分析[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,7 (10) :1488-1491.

[11]Sugie K,Nishino I.Complex IV(cytochrome c oxidase)[J].Nippon Rinsho,2002,60(Suppl 4):490-49.

[12]Pecina P,Houstkova H,Hansikova H,et al.Genetic defects of cytochrome c oxidase assembly[J].Physiol Res,2004,53(Suppl 1):S213-S223.

[13]Watanabe Y,Shiozuka K,Ikeda T,et al.Cloning of PCPTP1-Ce encoding protein tyrosine phosphatase from the rat cerebellum and its restricted expression in Purkinje cells[J].Brain Res Mol Brain Res,1993,58(1/2):69.

[14]顧衛(wèi)東,陳群,曾因明等.低溫對腦缺血/再灌注期間沙土鼠海馬CA1區(qū)延遲性神經(jīng)元死亡及ATP水平和細(xì)胞色素氧化酶活性的影響[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,29(1):4-7.

[15]Wang J,Silva JP,Gustafasson CM,et al.Increasedin vivoapoptosis in cells lackingmitochondrial DNAgene expression[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(7):4038-4043.

[16]Lu P,Nkorchevskiy A,Marcotte EM.Expression deconvolution: a reinterpretation of DNAmicroarray data reveals dynamic changes in cell population[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100 (18):10370-10375.

[17]Parrella P,Xiao Y,Fliss M,et al.Detection of mitochondrial DNA mutations in primary breast cancer and fine-needle aspirates[J].Cancer Res,2001,61(20):7623-7626.

[18]韓波,李凡,毛曉韻等.線粒體DNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)與胃癌發(fā)生關(guān)系研究[J].中國腫瘤臨床,2006,33(21):1205-1209.

[19]高靜,陳雯,張同霞等顳葉癲癇大鼠海馬線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅲ和Ⅳ表達(dá)的變化[J].山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2007,45(8):817-824.

[20]孫飛,周強(qiáng)軍,孫吉等.線粒體呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)[J].生命科學(xué),2008,20(4): 566-578.

[21]Kang S,Seo S,Hill J,et al.Changes in gene expression in latent HSV-1-infected rabbit trigeminal ganglia following epinephrine iontophoresis[J].Curr Eye Res,2003,26 (3/4):225-229.

[22]郭麗君,尚林輝,陳新等.糖尿病患者與百歲老人的線粒體細(xì)胞色素b基因單核苷酸多態(tài)性分析[J].中國糖尿病雜志,2008,16(5):257-259.

[23]張默函,金東洙,金映杉等線粒體DNA Cyt-b和血管內(nèi)皮生長因子mRNA在乳腺癌中的表達(dá)及意義[J].解剖學(xué)報,2008,39(4):562-565.

[24]付小全,曾柳根,洪一江等.天然三倍體鯽魚突變體萍鄉(xiāng)肉紅鯽線粒體細(xì)胞色素b基因序列分析[J].動物學(xué)雜志,2009,44(2):97-101.

[25]Chomyn A,Cleeter MW,Ragan CI,et al.URF6,last unidentified reading frame of human mtDNA,codes for an ADH dehydrogenase subunit[J].Science,1986,234:614-8.

[26]李傳連,樓哲豐,黃學(xué)鋒等.線粒體基因ND3、ND4L核苷酸變異與弱精子癥相關(guān)分析[J].中國病理生理雜志,2010,26(2):362-367.

[27]李明珍,于德民,劉德敏等.攜帶線粒體DNA ND4區(qū)12026A→G點突變的糖尿病家系臨床特點[J].中國糖尿病雜志,2008,16(5):260-264.

[28]魏佳,沈麗君,方合志等.線粒體ND5基因變異與乳腺癌關(guān)系初探[J].國際遺傳學(xué)雜志,2009,32(4): 26-27.

[29]李東,周新,李霞等.糖尿病與線粒體ND1點突變的關(guān)系[J].中國老年學(xué)雜志,2005,25(6):629-631.

The Research Progress of Protein Subunits Coded by The Mitochondrial DNA

CHEN Fei-xiong1, SHEN Lin-na2, PU Jun1, XU Wei1
(1 Department of Neurosurgery, The 2nd of Af fi liated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, Yunnan 650101,China;2 Department of Neurology, The 2nd of Af fi liated Hospital of Kunming Medical University, Kunming, Yunnan 650101,China)

The total length of the human mitochondrial DNA(double loop molecular chain)was 16,569 bp, the genome content of human including 2 rRNA,22 tRNA, and 13 protein-coding genes.The 13 protein-coding genes were NADH dehydrogenase subunits 1-6 and 4L genes; cytochrome c oxidase subunits I-III genes; cytochrome b gene; ATPase subunits 6 and 8 genes; In the present review ,the composition, the structure and function, the most signi fi cant studies on the 13 protein-coding genes are reported.

Mitochondrial genome; Mitochondria; NADH-CoQ reductase; CoQ-Cytc reductase; Cytochrome Coxidase; ATPase

Q5

A

1671-8194（2011）01-0006-03

云南省自然科學(xué)基金重點項目（2003C0010Z）