方肇勤，潘志強，盧文麗，吳中華，管冬元，梁 超，張園園，王艷明，丁善萍，顏 彥

肝癌是我國的重大疾病、難治病，療效提高緩慢［1］，因而探索和提高肝癌的療效是一項長期而艱巨的任務(wù)。中醫(yī)藥在我國肝癌防治中發(fā)揮著重要的作用，在改善患者生存質(zhì)量，延長帶瘤生存期等方面具有一定的優(yōu)勢。中醫(yī)藥防治肝癌的特點是辨證論治，即依據(jù)“同病異證”實施“同病異治”。因此，揭示同病異證的發(fā)生機制和物質(zhì)基礎(chǔ)，對于探索和發(fā)展辨證論治的療效是十分必要的。在肝癌等腫瘤藥效學(xué)和療效作用機制的研究中，腫瘤小鼠是最常用的模式生物。我們的前期研究表明，H22等腫瘤小鼠會自發(fā)形成氣血陰陽虛證，證情會發(fā)生自然演變和兼夾，與人類近似［2、3］，是研究同病異證和證候發(fā)生物質(zhì)基礎(chǔ)的理想實驗動物;進而的研究發(fā)現(xiàn)同病異證腫瘤小鼠普遍存在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)大量的基因表達差異和特征。最近，我們采用標(biāo)準(zhǔn)化、計量化小鼠診法和辨證方法［4、5］，在同步接種 H22肝癌細(xì)胞的荷瘤小鼠中篩選出若干組同病異證小鼠，采用ELISA方法檢測其血清中內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等多基因產(chǎn)物的含量，以進一步揭示其同病異證的物質(zhì)基礎(chǔ)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及造模

(1)動物:清潔級KM小鼠250只，雄性，體質(zhì)量22g±2g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司(動物生產(chǎn)許可證號為 SCXK(滬)2008-0003);動物使用許可證號為SYXK(滬)2009-0069;(2)隨機取20只為正常對照;(3)230只小鼠腋下接種H22腹水癌細(xì)胞，細(xì)胞濃度為4×107/ml，每只小鼠右腋下接種0.2ml細(xì)胞懸液。出瘤后第6～7天淘汰死亡和未出瘤小鼠，余180只腫瘤小鼠。

1.2 同病異證腫瘤小鼠檢測和篩選

1.2.1 接種后第7天診法檢測 計量化檢測指標(biāo)［12、13］包括:(1)體重;(2)腋溫;(3)曠場及計算35s內(nèi)水平跨格數(shù)和垂直站立數(shù);(4)抓力;(5)爪和尾顯微拍照及提取反映紅色程度的r值;(6)瘤長短徑。

1.2.2 計量化辨證及證候嚴(yán)重度計算 接種后第7天每只小鼠給予計量化辨證，證候及程度計算方法［1、2］如下:(1)估算瘤體積和瘤重(cm3)=abb/2(a代表腫瘤的長徑，b代表腫瘤的短徑，單位cm/g);(2)邪盛衰度 =瘤重/所有瘤重均數(shù)。辨證標(biāo)準(zhǔn):大于1.5為邪毒甚，大于2為邪毒壅盛，小于0.75為邪較弱，小于0.5為邪弱;(3)氣盛衰度=抓力/正常均數(shù) ×0.5+水平/正常均數(shù) ×0.3+站立/正常均數(shù) ×0.2。辨證標(biāo)準(zhǔn):與正常組比較，大于1.25為氣盛，小于 0.75為氣虛，小于 0.5為氣虛甚，小于0.25為氣虧;(4)陽盛衰度 =腋溫/正常均數(shù)。辨證標(biāo)準(zhǔn):與正常組比較，大于1.02為陽氣盛，小于0.98為陽虛，小于0.95為陽虛重，小于 0.9為陽損;(5)陰盛衰度=去瘤體重/正常體重均數(shù)。辨證標(biāo)準(zhǔn):與正常組比較，大于1.2為形豐，小于0.9為陰偏虛，小于0.85為陰虛，小于0.7為陰虧，小于0.6為液脫;(6)血盛衰度 =爪 r/正常均數(shù) ×0.7+尾r/正常均數(shù)×0.3。辨證標(biāo)準(zhǔn):與正常組比較，大于 1.1為血充盈，小于 0.95為血虛，小于 0.9為血虛重，小于0.85為血虧。

1.2.3 同病異證腫瘤小鼠篩選 不同組別的同病異證小鼠篩選方法:(1)正常對照組(正常組)。取氣血陰陽盛衰度居中者14只，其余淘汰。腫瘤小鼠以邪盛衰度大小排序，淘汰陽虛瀕臨死亡者;(2)邪毒壅盛瀕危者(邪危組)。取邪盛衰度最為嚴(yán)重且兼有輕度陽氣虛者21只(實際處死14只，以免次日部分自然死亡);(3)邪毒壅盛(邪毒組)。取邪盛衰度次于上組兼證少者17只(實際處死14只，以免次日部分自然死亡);(4)邪毒居中兼氣虛小鼠14只(氣虛組);(5)邪毒居中小鼠14只(邪中組);(6)邪毒微弱小鼠14只(邪微組)，其余腫瘤小鼠淘汰。

1.3 取材

(1)接種后第8天，摘除眼球取血制備血清，－80℃保存。各組取14只小鼠(邪危組隨機淘汰3只存活小鼠);而氣虛組僅存10只，邪中組13只。常規(guī)分離血清，血清樣本少者2只樣本合并，以保證同一份血清夠檢測所有指標(biāo);(2)引頸處死實驗動物，分離腫瘤、睪丸、胸腺、脾臟等稱重。

1.4 試劑盒及檢測方法

采用的ELISA試劑盒及各自所提供的方法:(1)ACTH(1-39，mouse，rat)(美 國，Peninsula Laboratories);(2)Mouse TSH(美國 Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd.);(3)Mouse Aldosterone(美國，Assay Designs，Inc);(4)Mouse Tri-iodothyronine(美 國，CALBIOTECH Inc.);(5)Mouse thyroxine(美 國，CALBIOTECH Inc.);(6)Mouse Free Tri-iodothyronine Indes(武 漢 EIAab Science Co.，Ltd);(7)Mouse Free Thyroxine(武漢EIAab Science Co.，Ltd);(8)Testoterone(美 國，R＆D Systems，Inc.);(9)Mouse IL-2(美國，R＆D Systems，Inc.);(10)Mouse IL-10(美 國，R＆D Systems，Inc.);(11)Mouse IL-12 p70(美國，R＆D Systems，Inc.);(12)Mouse TNF-α (美 國，R＆D Systems);(13)Mouse IFN-γ(美國，R＆D Systems)

1.5 統(tǒng)計方法

(1)實驗結(jié)果取存活并取材小鼠診法和辨證指標(biāo)統(tǒng)計，以便與各實驗室檢測指標(biāo)比較:(2)采用單因素方差分析及SPSS15.0數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠存活情況

230只小鼠在接種后，第6天去除未出瘤或出瘤不佳如破潰等小鼠10只，剩余220只，當(dāng)日有3只小鼠死亡。第7天，診法和辨證前出現(xiàn)44只小鼠死亡，提示該批次實驗荷瘤小鼠腫瘤發(fā)展快、預(yù)后差。

接種后第8天(處死小鼠當(dāng)天)，邪危組21只中自然死亡4只，邪毒組17只中自然死亡3只，氣虛組14只中自然死亡4只，邪中組14只中自然死亡1只(死亡率見圖1)。提示:(1)邪盛衰度大小確與預(yù)后有關(guān)［2］;(2)本實驗氣虛組死亡率偏高，可能與氣虛嚴(yán)重有關(guān)。

2.2 各組小鼠邪盛衰度與實際瘤重

(1)邪盛衰度。邪危組、邪毒組、氣虛和邪中組、邪微組等邪盛衰度依次減小，除氣虛組與邪中組接近外，差異均有統(tǒng)計意義(P＜0.05)，表明采用計量化辨證分組是可行的(圖2);(2)次日腫瘤取材。邪危組、邪毒組、邪中組、邪微組等實際瘤重依次減輕，與邪盛衰度近似(圖3)，其中邪中組、邪微組與其他組比較差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05)，表明體表測量及計算瘤體積方法正確。值得注意的是，氣虛組瘤重明顯大于邪中組，提示在小鼠四診檢測到處死間約20h內(nèi)，氣虛組腫瘤增殖快，這也可能是該組死亡率高、預(yù)后差的原因。

2.3 各組小鼠氣血陰陽盛衰度

(1)腫瘤發(fā)生后，荷瘤小鼠會自發(fā)形成氣虛，并隨著病情發(fā)展和邪盛衰度嚴(yán)重而加?。?］。本實驗結(jié)果近似，總體上邪盛衰度愈重氣虛程度也愈重(圖4);其中與正常組比較，邪危組、邪毒組、氣虛組差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。氣虛組氣盛衰度最小，除邪危組外，與其他組比較差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。依據(jù)氣盛衰度辨證標(biāo)準(zhǔn)［4、5］與正常組比較，小于0.5為氣虛甚，表明本實驗氣虛組的氣虛程度十分嚴(yán)重，這可能是其預(yù)后差的主要原因;(2)腫瘤發(fā)生后，荷瘤小鼠會自發(fā)形成陽虛，并隨著病情發(fā)展與邪盛衰度嚴(yán)重而加?。?］。本實驗結(jié)果近似，總體上邪盛衰度愈嚴(yán)重陽虛程度也愈嚴(yán)重(圖5)。其中與正常組比較，邪危組陰盛衰度下降，差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05);(3)當(dāng)腫瘤發(fā)展至中晚期，荷瘤小鼠會自發(fā)形成陰虛。本實驗未見陰虛表現(xiàn)(圖6);(4)腫瘤發(fā)生后，荷瘤小鼠會自發(fā)形成血虛，并隨著病情發(fā)展和邪盛衰度嚴(yán)重而加?。?］。本實驗結(jié)果近似，總體上邪盛衰度愈嚴(yán)重血虛程度也愈嚴(yán)重(圖7)。其中與正常組比較，邪危組、邪毒組血盛衰度下降，差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。

圖1 各組入選小鼠隔夜死亡率

圖2 各組小鼠邪盛衰度

圖3 各組小鼠瘤重

圖4 各組小鼠氣盛衰度

2.4 同病異證小鼠內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的特征

2.4.1 腎上腺軸 (1)在腫瘤發(fā)生的早期，應(yīng)激使垂體ACTH合成與釋放增加。本實驗與正常組比較，各組均顯著升高(P＜0.05)，且總體上與邪盛衰度呈正相關(guān)，但各組總量接近，沒有顯著差異(圖8)。提示:對于邪毒壅盛及瀕危荷瘤小鼠，垂體呈現(xiàn)出失代償征兆;同時垂體儲備有限，應(yīng)激反應(yīng)可能接近其極限;(2)與ACTH對應(yīng)，腫瘤發(fā)生腎上腺醛固酮分泌增加，總體上與邪盛衰度呈正相關(guān)(圖9)，邪中組與邪微組差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。其中邪危組下調(diào)，提示該組小鼠腎上腺出現(xiàn)失代償。鑒于醛固酮組間差異大，提示在受到ACTH的刺激后，還存在其他因素進一步調(diào)整和促進腎上腺醛固酮的分泌。

圖5 各組小鼠陽盛衰度

圖6 各組小鼠陰盛衰度

圖7 各組小鼠血盛衰度

圖8 各組小鼠血清ACTH含量

2.4.2 甲狀腺軸 (1)從邪中組和邪微組血清TSH含量升高看(與邪危組、邪毒組、氣虛組比較，差異具有統(tǒng)計意義，P＜0.05)，在腫瘤發(fā)生的早期，垂體TSH處于積極的應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)(圖10)。但隨著腫瘤的增大，邪危組、邪毒組和氣虛組 TSH含量下降。提示可能系垂體的儲能有限，在盡力滿足ACTH表達的同時，限制了 THS的表達;(2)與TSH對應(yīng)，小鼠甲狀腺T3、T4血清含量與腫瘤大小和增速負(fù)相關(guān)。在腫瘤早期，T3有升高趨勢，而隨著邪盛衰度程度增加，如邪危組顯著下降，與邪中組比較，差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05);而 T4在腫瘤發(fā)生后迅速抑制，與正常組比較，各組均顯著下調(diào)(P＜0.05);其中邪中組、邪微組與其余腫瘤小鼠組比較，差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。顯然，與腎上腺軸相反，甲狀腺軸以抑制為主(圖11、12);(3)小鼠FT3、FT4血清含量T3、T4趨勢一致，但可以維持在較高和正常水平，其中FT3顯著升高(圖13，正常組比較，除邪毒組外其他各組差異均有統(tǒng)計意義，P＜0.05)，邪中組、邪微組與其余腫瘤各組差異均有差異(P＜0.05);FT4總體上有升高趨勢(圖14)，其中邪微組與邪毒組、氣虛組比較差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05)，提示一些不明的機制在促進 T3、T4的轉(zhuǎn)化和利用。

圖9 各組小鼠血清醛固酮含量

圖10 各組小鼠血清TSH含量

圖11 各組小鼠血清T3含量

圖12 各組小鼠血清T4含量

2.4.3 性腺軸 (1)在腫瘤發(fā)生的早期，荷瘤小鼠睪丸有重量減輕趨勢，氣虛組與各組比較下降顯著(P＜0.05，圖15)，提示氣虛與性腺的關(guān)系密切，這也可能與該組預(yù)后差有關(guān);(2)各組小鼠血清睪酮含量與THS模式近似:腫瘤早期邪毒微弱者有上調(diào)趨勢，而邪毒壅盛和預(yù)后差者，顯著下調(diào)(圖16)。與腎上腺軸相反，性腺軸也以抑制為主。

圖13 各組小鼠血清FT3含量

圖14 各組小鼠血清FT4含量

圖15 各組小鼠睪丸重量

圖16 各組小鼠血清睪酮含量

2.4.4 免疫系統(tǒng) (1)胸腺重量。在腫瘤發(fā)生的早期，荷瘤小鼠胸腺已見減輕，其中邪危組、邪毒組、氣虛組與正常組比較，差異具有統(tǒng)計意義(P＜0.05);腫瘤邪毒程度嚴(yán)重者抑制更顯著，其中危組、邪毒組、氣虛組與邪中組比較，差異具有統(tǒng)計意義(P＜0.05)，氣虛證尤甚(圖17);(2)脾臟重量。在腫瘤發(fā)生的早期，荷瘤小鼠脾臟一致增重，與正常組比較差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05)，但各腫瘤組間差距不大(圖18);(3)IL-2。小鼠IL-2表達量低，且個體差異大。在腫瘤發(fā)生的早期，荷瘤小鼠血清IL-2水平呈下降趨勢(圖19)，與胸腺萎縮的趨勢一致;(4)IL-10。荷瘤小鼠血清IL-10一致升高趨勢，與腫瘤大小趨勢一致，僅邪危組例外(圖20);其中邪毒組與正常組比較，差異具有統(tǒng)計意義(P＜0.05);(5)IL-12。正常小鼠幾乎檢測不到，而荷瘤小鼠血清IL-12顯著升高，與腫瘤大小趨勢相反;氣虛證預(yù)后差者例外(圖21);(6)腫瘤壞死因子-α。小鼠TNF-α表達量低，正常小鼠檢測不到且個體差異大。腫瘤發(fā)生后，TNF-α表達量上升，且與腫瘤體積呈負(fù)相關(guān)，僅邪微組除外(圖22);(7)干擾素-γ。與TNF-α一致，腫瘤發(fā)生后 IFN-γ表達量上升，與正常組比較除邪微組外，差異均有統(tǒng)計意義(P＜0.05)，且與腫瘤體積呈負(fù)相關(guān)(圖23)。

圖17 各組小鼠胸腺重量

圖18 各組小鼠脾臟重量

圖19 各組小鼠血清IL-2含量

圖20 各組小鼠血清IL-10含量

圖21 各組小鼠血清IL-12含量

圖22 各組小鼠血清腫瘤壞死因子-α含量

圖23 各組小鼠血清干擾素-γ含量

3 討論

3.1 肝癌小鼠的同病異證及實驗設(shè)計考慮

接種同樣數(shù)量的H22腹水癌細(xì)胞，在小鼠出瘤的早期腫瘤體積差異很大，是典型的“同病異證”。此外，部分小鼠還會出現(xiàn)典型的氣虛，是同病異證的另一表現(xiàn)。鑒于邪盛衰度與預(yù)后有關(guān)［2］，觀察不同程度的邪盛衰度小鼠內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的改變是揭示其同病異證物質(zhì)基礎(chǔ)的有效途徑。因此，我們依據(jù)邪盛衰度篩選并分成4個組別:邪危組、邪毒組、邪中組、邪微組。同時鑒于氣虛是該階段常見兼證，篩選出邪毒居中兼氣虛小鼠(可與邪毒居中對照)。這樣，與正常對照組一道共計6個組別，便于相互比較與對照。

3.2 以腫瘤大小作為辨證條件依據(jù)

中醫(yī)學(xué)辨證論治往往抓住反映證候本質(zhì)的四診信息，而不在于四診信息采集的多寡［6］，因而有“但見一證便是”的說法。腫瘤體積的大小，綜合反映了痰熱瘀毒病邪的嚴(yán)重程度。在相同造模條件下(接種同樣數(shù)量的腫瘤細(xì)胞，以及接種后相同的時間)，腫瘤體積大者，痰熱瘀毒邪盛，腫瘤發(fā)生和增殖快，預(yù)后差;腫瘤體積小者，痰熱瘀毒邪微，腫瘤發(fā)生和增殖慢，預(yù)后好［2］。依據(jù)我們以往大量的研究，以及本實驗結(jié)果看，按腫瘤體積的大小篩選的同病異證小鼠，的確存在內(nèi)分泌和免疫客觀的差異和特征性的表現(xiàn)，驗證了辨證的合理性及其同病異證的客觀性。邪毒證候的形成確有其復(fù)雜的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.3 因?qū)嵵绿摵鸵蛱撝聦嵉囊蚬P(guān)系

與人類腫瘤的發(fā)生機制不同，H22荷瘤小鼠沒有長期的肝臟受損、纖維化和異常增殖等背景，之前的免疫系統(tǒng)也處于正常狀態(tài)，所有的改變均發(fā)生在外來腫瘤細(xì)胞的接種之后。因此，從發(fā)病學(xué)角度看，是因?qū)嵵绿?甲狀腺軸、性腺軸機能減退以及氣血陰陽虛證的發(fā)生)。但是，為什么接種同樣數(shù)量的腫瘤細(xì)胞會發(fā)生如此多變的同病異證呢?其內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)與證候嚴(yán)重程度的對應(yīng)性改變，可能與腫瘤細(xì)胞及接種局部環(huán)境、內(nèi)分泌和免疫儲備差異有關(guān)，這還需要更多的實驗去解釋。

3.4 檢測指標(biāo)和試劑盒方面的考慮

定購小鼠皮質(zhì)酮試劑盒進口試劑盒周期長且保質(zhì)期短，依據(jù)我們前期研究發(fā)現(xiàn)，同病異證小鼠皮質(zhì)酮與醛固酮濃度有類似的改變，因而本實驗僅采用了小鼠醛固酮試劑盒。此外，鑒于難以購買到同一公司小鼠FT3、FT4試劑盒，我們采用了另一公司的產(chǎn)品，這導(dǎo)致兩類試劑盒有關(guān)濃度描述的差異，希望組間差異的對比是客觀的。

總之，荷瘤小鼠存在同病異證及其內(nèi)在復(fù)雜及特征性的內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的改變。本研究為荷瘤小鼠個體化辨證論治及其療效評價提供了客觀的依據(jù)，也為比較和優(yōu)化辨證論治方案提供了模式生物的依據(jù)。

［1］ 湯釗猷.從肝癌看癌癥臨床研究［J］.腫瘤，2009，29(1):1-3.

［2］ 方肇勤，侯 俐，盧文麗，等.荷瘤小鼠證候的發(fā)生、演變、兼證及預(yù)后［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2007，411(1):57-62.

［3］ 潘志強.方肇勤，盧文麗，等.不同品系H22肝癌小鼠證候特征的比較研究［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，25(1):56-58.

［4］ 方肇勤主編.辨證論治實驗方法學(xué)——實驗小鼠診法和辨證［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

［5］ 方肇勤主編.大鼠/小鼠辨證論治實驗方法學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2009.

［6］ 方肇勤.中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)制定的若干關(guān)鍵問題［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2006，40(1):11-13.