董劍輝,熊惠軍,宋 立,陳 瑞

(1.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東廣州510642;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

沙門菌(Salmonella)是一群寄生于人和動物腸道內(nèi)的無芽胞直桿菌,由其感染引發(fā)的沙門菌病是一種重要的人獸共患病[1],其中許多血清型菌能在人和動物之間交叉感染,對人類、畜禽飼養(yǎng)業(yè)造成巨大危害,因此,預(yù)防和治療沙門菌感染顯得尤為重要[2]。抗生素在防治畜禽疾病中起著重要作用,但隨著抗菌藥在畜牧業(yè)上的廣泛使用,細菌的耐藥性不斷加劇和蔓延,因此帶來的耐藥問題、食品安全問題及公共衛(wèi)生問題也越來越嚴重,已引起了全球的關(guān)注[3-4]。加強沙門菌耐藥性的研究,對預(yù)防和控制沙門菌病的流行具有重要意義。目前,傳統(tǒng)的血清分型方法已經(jīng)不能滿足要求,需要采用分型能力更強的分子分型方法進一步分析不同來源的沙門菌之間的聯(lián)系。脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型方法為目前國際上分子分型的通用方法[5-6]。

本試驗對中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所檢測技術(shù)研究室2009年在北京地區(qū)所采集的病料進行分離鑒定。并用臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Iaboratory Standards Institute,CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法進行藥物敏感性測定,采用PFGE方法對分離菌株進行分子分型研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2009年4月從北京地區(qū)某養(yǎng)雞場采集的泄殖腔拭子、肝臟、卵黃囊。質(zhì)控菌株ATCC25922由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所檢測技術(shù)研究室提供。PFGE相對分子質(zhì)量標準采用沙門菌Braenderup血清型全球參考菌株H9812。

1.1.2 主要試劑及儀器 麥康凱培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、MH肉湯均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障室提供;抗菌藥藥敏板購自天津金章科技發(fā)展有限公司;限制性內(nèi)切酶XbaⅠ購自Promega公司;PFGE專用瓊脂糖Seakem Gold購自Rockland公司;蛋白酶K購自Merck公司;API ID 32E試紙條、ATB細菌鑒定儀均購自法國bioMerieux公司;Riboprinter全自動微生物基因指紋鑒定儀購自美國Du Pont公司;脈沖場凝膠電泳儀為Bio-Rad公司CHEF-DRⅢ型。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離 將所采集樣品接種于3 mL～5 mL滅菌四硫磺酸鹽增菌液中,42℃培養(yǎng)24 h;用接種環(huán)挑取新鮮培養(yǎng)的增菌液,沙門菌顯色培養(yǎng)基上劃線,37℃恒溫培養(yǎng)16 h～18 h;挑取紫色單菌落,接種營養(yǎng)瓊脂,37℃恒溫培養(yǎng)16 h～18 h。

1.2.2 細菌的鑒定 按照API ID 32E試紙條操作步驟將分離到的細菌接種到試紙條上,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,用ATB細菌鑒定儀鑒定分離到細菌的種類。用Riboprinter全自動微生物基因指紋鑒定儀鑒定其血清型。

1.2.3 耐藥性測定 用藥敏板進行檢測,試驗方法和判斷標準參考CLSI所推薦的微量肉湯稀釋法。用ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳

1.2.4.1 細菌處理 將分離的沙門菌及標準株H9812復(fù)蘇。用滅菌棉簽取適量細菌,懸浮于1 mL CSB溶液中,用紫外分光光度計調(diào)節(jié)菌液的OD620nm值至1.5～1.6。

1.2.4.2 制備膠塊 取200 μ L細菌懸浮液于2 mL離心管中,置于37℃水浴中孵育5 min。每管加入5 μ L濃度為20 mg/mL蛋白酶K。并加入200 μ L已融化并在56℃水浴平衡的10 g/L的Seakem Gold瓊脂糖溶液(含10 mL/L SDS),用移液器加入膠塊制備模具。

1.2.4.3 細菌裂解 在50 mL的離心管中加入5 mL的細胞懸浮緩沖液CLB,然后再加入25 μ L的濃度為20 mg/mL蛋白酶K,從模具中取出細菌包埋膠塊放入到離心管中,54℃搖床中孵育6 h,搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。

1.2.4.4 洗滌膠塊 倒掉混合液,加入15 mL 50℃預(yù)熱的去離子水。50℃搖床洗滌10 min,洗滌2次。用50℃預(yù)熱的TE buffer同樣條件洗滌4次。

1.2.4.5 XbaⅠ酶切 在2 mL離心管中加入200 μ L膠塊平衡液,將洗滌過的膠塊切成2 mm寬的膠條,放入膠塊平衡液中,37℃孵育10 min,棄平衡液,加入200 μ L酶切溶液(175 μ L去離子水:20 μ L buffer:5 μ L XbaⅠ酶),37℃孵育12 h,棄酶切液。加入200 μ L 0.5×TBE電泳緩沖液平衡5 min。

1.2.4.6 加樣 取出膠塊,第1、7、15齒各加1個H9812菌膠塊作為Marker,其余各齒依次加樣品。將梳子放入膠槽,緩慢倒入100 mL熔化后并在60℃水浴平衡的10 g/L Seakem Gold瓊脂糖溶液。

1.2.4.7 電泳 加2 200 mL 0.5×TBE電泳緩沖液,電泳時間19 h,電泳溫度為14℃。

1.2.4.8 染色 電泳后將膠放入含0.5 μ g/mL EB的染液中染色30 min,然后用去離子水脫色1 h。1.2.4.9 成像及分析 用凝膠成像儀成像,并用Info Quest FP聚類分析軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定結(jié)果

本次試驗從所采集樣品中共分離出16株沙門菌。其中,腸炎沙門菌15株,分別從泄殖腔拭子、肝臟、卵黃囊中各分離出3株、7株、5株;鼠傷寒沙門菌1株,分離于卵黃囊。

2.2 藥敏試驗結(jié)果

由以下23種被測藥物的藥敏試驗結(jié)果和耐藥譜(表1和表2)可以看出,16株雞源沙門菌對獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物耐藥率較高,利福平為100.00%,萘啶酸為100.00%,多黏菌素E為88.24%;對阿米卡星、大觀霉素、氟苯尼考、安普霉素等均敏感。受試菌對被測藥物的多重耐藥現(xiàn)象較為嚴重。

表1 藥敏試驗結(jié)果T able 1 The result of antimicrobial sensitivity test

表2 16株雞源沙門菌的耐藥譜T able 2 Drug-resistant spectrium of 16 Salmonella gallinarum strains

2.3 PFGE結(jié)果

16株沙門菌經(jīng)XbaⅠ酶切,PFGE后,每個菌株產(chǎn)生10條～15條電泳條帶,大小在20 kb～1 200 kb之間,部分菌株的PFGE結(jié)果(圖1)。

圖1 部分沙門菌PFGE圖譜Fig.1 Representative PFGE patterns of 12Salmonellastrains

2.4 聚類分析結(jié)果

用Info Quest FP聚類分析軟件分析15株腸炎沙門菌PFGE圖譜(圖2)顯示,其相似度在87.6%～100%之間,共分為A型和B型兩個帶型,其中A型共有14株,B型僅有1株,A型為優(yōu)勢帶型(占總數(shù)的93.33%)。

圖2 15株腸炎沙門菌的聚類分析圖Fig.2 The cluster analysis figure of 15 S.enteritidis strains

3 討論

沙門菌是一種常見的人獸共患病病原菌,不僅能導(dǎo)致雞白痢、禽傷寒和禽類副傷寒等疾病,而且也能引起人類傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎等疾病。進行沙門菌耐藥性的監(jiān)測不僅可指導(dǎo)臨床用藥、預(yù)防禽類重大沙門菌病的流行,而且在公共衛(wèi)生方面也有重要的意義[7-8]。

本試驗對分離出的16株沙門菌進行血清型鑒定,結(jié)果表明有腸炎沙門菌15株(93.75%),鼠傷寒沙門菌1株(6.25%),優(yōu)勢血清型為腸炎沙門菌,與國內(nèi)文獻報道一致[9-10]。在16株受試菌中,多重耐藥菌株數(shù)為16株,占受試菌的100%,說明此次分離的腸炎沙門菌耐藥現(xiàn)象比較嚴重。耐藥率較高的藥物為利福平、萘定酸、多黏菌素E,在88.24%～100%之間,可能與這3種藥物問世早,臨床應(yīng)用時間較長有關(guān)。受試菌對阿米卡星、大觀霉素、安普霉素非常敏感,在治療北京地區(qū)的腸炎沙門菌感染時可作為首選藥物。腸炎沙門菌對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、頭孢唑林、頭孢噻呋及頭孢曲松的耐藥率均為6.25%,表明氟喹諾酮類藥物和頭孢類藥物對腸炎沙門菌也具有較好的抗菌活性。從本試驗結(jié)果來看,氟喹諾酮類藥物和頭孢類藥物對腸炎沙門菌的抗菌效果相當,可用這兩類藥物作為治療該地區(qū)腸炎沙門菌感染的首選藥物,但由于頭孢類抗生素價格昂貴,從經(jīng)濟角度考慮,在治療腸炎沙門菌感染時,選用氟喹諾酮類藥物更為合理。

沙門菌傳統(tǒng)的分型方法只能從血清型、噬菌體、耐藥譜分型上去區(qū)分,這些分型都是從細菌的表型上進行分型[11]。由于微生物易受環(huán)境的影響,很容易改變其表達性狀,使得表型分類很不準確[12-13]。PFGE技術(shù)是基于DNA結(jié)構(gòu)的分子分型方法,被認為是進行分子分型的可信方法,在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于菌種的分子流行病學研究[14-16]。本試驗用PFGE技術(shù)將腸炎沙門菌分型,試驗結(jié)果表明北京地區(qū)的腸炎沙門菌分為A、B兩個型,其中A型為該地區(qū)的優(yōu)勢基因型,而且同源性較高。同一血清型之間的PFGE圖譜也有一定的差異,說明PFGE分型比傳統(tǒng)的血清型分型更加精細,能在分子水平上對其分型。雖然PFGE基因分型技術(shù)比傳統(tǒng)的表型分型方法費時、費力,但是其在調(diào)查細菌親緣關(guān)系方面比后者更有優(yōu)勢。PFGE技術(shù)在今后可能會更廣泛地運用于分子分型和流行病學研究,并在追蹤傳染源和傳播途徑中發(fā)揮重要作用。

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