楊 芳,王廣策,張寶玉,陳張帆,潘光華

(1.天津科技大學(xué),天津 300457;2.中國科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071)

潮間帶是指大潮高潮線與大潮低潮線之間的海岸帶,是由海洋向陸地過渡的中間地帶。該地區(qū)在高潮時被海水淹沒,具有一定的海洋環(huán)境特性;低潮時露出,又具有一定的陸地環(huán)境特性,因此潮間帶是研究生物由海洋進化到陸地的關(guān)鍵區(qū)域。除了潮水漲落的變化外,潮間帶地區(qū)的鹽度、光照、溫度等其他環(huán)境因子水平的變化幅度也很大。在這種海陸交替的特殊地區(qū)生存著許多具有特殊生活習(xí)性的物種,構(gòu)成了獨特的生態(tài)系統(tǒng)。這些生物不僅適應(yīng)了潮漲潮落,對周期性的脫水和復(fù)水具有很好的耐受力,對環(huán)境因子水平的大尺度周期性變化也具有很強的適應(yīng)性。

紫菜是重要的潮間帶大型紅藻。因含有較高含量的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、碳水化合物和膳食纖維,紫菜早已成為人類的食物[1];紫菜養(yǎng)殖業(yè)在中國、日本、韓國等國家也已經(jīng)成為大規(guī)模的大型海藻產(chǎn)業(yè)之一。條斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda)是紫菜屬中的重要物種,主要生長在太平洋西北部包括中國東部沿岸在內(nèi)的大部分地區(qū),日本和韓國沿岸[2]。研究表明條斑紫菜具有耐干出的特點,暴露在空氣中幾天仍然能夠在海水中完全恢復(fù)[3]。利用條斑紫菜的耐干出特點,將其在空氣中人工干出已經(jīng)成為條斑紫菜養(yǎng)殖和保種的重要應(yīng)用技術(shù)之一。條斑紫菜的半浮筏式養(yǎng)殖法就是讓附著在養(yǎng)殖網(wǎng)上的紫菜隨潮汐漲落經(jīng)歷脫水(干出)復(fù)水過程。這種養(yǎng)殖方法很適合在潮汐落差較大的潮間帶[2]。海水養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)驗證明,在空氣中適當(dāng)干出藻體可以增強藻體對病害的抵御能力,去除競爭性雜藻,如硅藻,從而提高紫菜的質(zhì)量和產(chǎn)量[2]。此外,傳統(tǒng)的保存條斑紫菜葉狀體的方法是將紫菜放在陰涼處迅速晾干置于-20℃保存,這種保存方法在發(fā)展中國家仍然很常用。如果將藻體脫水至含水量 20%左右,藻體可以保存將近 12個月[2]。由此可見,條斑紫菜的養(yǎng)殖和保種都得益于其耐干出特性,這使得研究脫水對條斑紫菜的影響意義重大。

光合作用受到多種環(huán)境因子的影響,其中影響最大的因素就是水分[4]。因此,很多人研究了潮間帶大型海藻在脫水過程中的光合活性的變化。研究發(fā)現(xiàn)一些潮間帶大型海藻在適度脫水時光合速率會顯著增強[3,5-8];而腹枝藻[9],壇紫菜[10]和半葉紫菜[4]在適度脫水過程中則沒有光合速率增大的現(xiàn)象。但是,這些研究多是停留在生理水平上,很少有報道涉及大型海藻在脫水過程中的分子水平的變化機制。條斑紫菜作為光能自養(yǎng)型生物,其光合作用對水分變化十分敏感,但是其又具有脫水?dāng)?shù)小時后遇水能快速恢復(fù)的特性,并且這種特性被廣泛應(yīng)用于條斑紫菜的養(yǎng)殖和保種業(yè)中。因此,在分子水平上研究條斑紫菜光合作用的相關(guān)蛋白對脫水復(fù)水的響應(yīng)機制具有十分重要的意義。

葉綠體是進行光合作用非常重要的細胞器。條斑紫菜的葉綠體為星狀,很不規(guī)則,從進化的角度上說屬于很低等的[11]。在條斑紫菜葉綠體內(nèi)的類囊體膜上鑲嵌有光系統(tǒng) I ( PSⅠ) 和光系統(tǒng)Ⅱ( PSⅡ)蛋白復(fù)合體。PSⅡ的反應(yīng)中心是反應(yīng)中心蛋白結(jié)合P680、去鎂葉綠素等電子傳遞體的復(fù)合物,該復(fù)合物將電子由PSⅡ傳遞給PSⅠ,從而完成光合作用重要步驟[12]。PSⅡ的D1 和D2兩個反應(yīng)中心蛋白分別由葉綠體基因psbA 和psbD編碼。因此,研究藻類的psbA 和psbD基因?qū)ρ芯科涔夂献饔镁哂兄匾饬x。對于條斑紫菜,陳張帆等人研究了其不同生長階段——殼孢子、孢子體和葉狀體,psbA 和psbD基因轉(zhuǎn)錄水平的不同,結(jié)果表明不同階段的條斑紫菜psbA 和psbD轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達量不同,認(rèn)為殼孢子發(fā)育成葉狀體的過程需要光合作用提供能量[13]。而有關(guān)條斑紫菜的psbA 和psbD在脫水復(fù)水過程中表達量的變化尚未見報道。

本實驗選取處于不同脫水和復(fù)水階段的條斑紫菜葉狀體為材料,對其psbA和psbD轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達量進行研究,以探討組裝 PSⅡ的中心蛋白(D1,D2蛋白)的基因在條斑紫菜處于不同脫水復(fù)水階段時的變化。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及制備

條斑紫菜葉狀體于 4月份采于青島第一海水浴場,用滅菌海水沖洗干凈。吸干藻體表面可見水珠,稱取適量藻體于密閉塑料袋中,-80℃冰箱保存,作為相對含水量為100%的實驗材料。將剩余藻體進行陰干處理,讓其于實驗室條件下自然脫水 15 min、60 min和105 min,分別于密閉塑料袋中-80℃冰箱保存。剩余藻體進行復(fù)水30 min處理后于密閉塑料袋中-80℃冰箱保存。

1.2 樣品相對含水量的測定及定量PCR分析

1.2.1 條斑紫菜體葉狀體相對含水量測定

相對含水量測定方法：吸干藻體表面可見水珠,用分析天平稱初始質(zhì)量。與1.1.2同種處理方法對藻體進行脫水處理,每15 min測定1次藻體質(zhì)量。最后 1次稱質(zhì)量后,將藻體置于 60℃烘箱中,烘干至恒質(zhì)量(約48 h),作為藻體干質(zhì)量,并計算相對含水量(3個平行樣)。

相對含水率(RWC)計算公式：

其中,W0為初始質(zhì)量(g),Wt為特定時間藻體質(zhì)量(g),Wd為藻體干質(zhì)量(60℃,48 h)。

1.2.2 總RNA提取

將100 mg條斑紫菜葉狀體樣品分別于液氮中充分研磨至粉末狀,轉(zhuǎn)移到 1.5 mL離心管中。加入1 mL Trizol(Invitrogen)試劑混勻,室溫放置5 min。13 000g,4℃,離心1 0 min。取上清移至新離心管中。加入200 μL預(yù)冷的氯仿,振蕩15 s,室溫下靜置2～3 min。13000g,4℃,離心15 min。取上清移至新離心管中。加入500 μL預(yù)冷的異丙醇,于-20℃冰箱中靜置 20～30 min。13 000g,4℃,離心 10 min。棄上清,沉淀中加入1 mL 預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀。10 000g,4℃,離心5 min。棄上清,于超凈工作臺中風(fēng)干 5 min。加入適量的 DEPC水溶解 RNA,于-80℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。

1.2.3 總RNA中微量DNA的去除

提取的總 RNA中加入 RQ1 Rnase-Free Dnase(Promega),37℃,30 min消化DNA。加入4 μL Stop Solution,65℃反應(yīng)10 min,終止消化反應(yīng)。

1.2.4 cDNA合成

根據(jù) M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)的說明書,在新的離心管中加入隨機引物(100μmol/L)2.7 μL,消化好的RNA模板10.65 μL。70℃,變性5 min。轉(zhuǎn)移到冰上冷卻 2 min。在離心管中加入：M-MLV 5?Reaction Buffer 5μL,dNTP mix(10 mmol/L)5 μL,RNase Inhibitor 0.65 μL,M-MLV RT 1μL。36℃,反轉(zhuǎn)錄60 min。稀釋1 000倍作為熒光定量PCR的模板,于-20℃保存待用。

1.2.5 熒光定量PCR

熒光定量PCR所用引物及反應(yīng)條件引用陳張帆的實驗方法[13],引物由上海生工合成。每個樣品均重復(fù)3管,設(shè)空白對照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)△△CT法[14]分析數(shù)據(jù)。計算psbA和psbD的相對表達量的差異,采用t檢驗方法進行兩兩比較以判斷有無顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 條斑紫菜葉狀體相對含水量測定結(jié)果

在條斑紫菜干出過程中每隔15 min測定一次材料的質(zhì)量,計算出實驗所用條斑紫菜葉狀體的相對含水量,并擬合出相對含水量與材料脫水時間的關(guān)系曲線。根據(jù)所得數(shù)據(jù)可以確定條斑紫菜在未脫水,脫水15 min、60 min和105 min時藻體的相對含水量分別約為100%、71%、34%和21%。

2.2 樣品總RNA的檢測

獲得的樣品的總 RNA在電泳圖譜(圖1)中出現(xiàn)28S,18S rRNA清晰的電泳帶,1,2,3,4,5所對應(yīng)的條帶從下到上分別為5S,18S,28S rRNA。本研究使用的總RNA含量較高,純度好且無降解。

圖1 條斑紫菜總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RNA extracted from Porphyra yezoensis with various relative water content (RWC) of rehydration

2.3 psbA、psbD相對表達量的變化

如圖2所示,psbA、psbD基因在脫水過程中相對表達量呈先增大后減小的趨勢,并且psbA基因的相對表達量的變化幅度比psbD基因要大。在含水量約為 71%時兩基因的相對表達量均達到最大,此時,psbA基因的相對表達量是正常狀態(tài)(相對含水量100%)下該基因的相對表達量的 7.18倍(P <0.01);psbD基因的相對表達量是正常狀態(tài)下該基因的相對表達量的3.13倍(P <0.01);psbA基因的相對表達量是psbD基因的相對表達量的2.29倍(P <0.05)。進一步脫水的過程中,兩個基因的相對表達量都降低,當(dāng)含水量達到21%時兩基因的相對表達量基本持平,且都比正常狀態(tài)下的相對表達量低(P <0.01)。復(fù)水后,psbA基因的相對表達量是正常狀態(tài)下的0.68倍(P <0.01);psbD基因的相對表達量是正常狀態(tài)下的0.30倍(P <0.01);此時,psbA基因的相對表達量是psbD基因的相對表達量的2.25倍(P <0.01)。

圖2 Real-time PCR檢測不同脫水復(fù)水階段的條斑紫菜細胞中psbA, psbD基因的轉(zhuǎn)錄水平上相對表達量的變化Fig.2 Variations in psbA and psbD transcript levels using real-time PCR.Total RNA was isolated from samples with various relative water content (RWC) of rehydration

3 討論

條斑紫菜葉狀體中具有很高的多糖和蛋白含量,這給提取純度較高質(zhì)量較好的RNA帶來了困難。本研究通過Trizol法得到了條斑紫菜葉狀體的總RNA中18S和28S rRNA,其電泳條帶都較清晰且沒有拖尾降解現(xiàn)象,表明通過這種方法提取的RNA質(zhì)量較好。熒光定量PCR技術(shù)是一種可以檢測低豐度基因表達的技術(shù)。本實驗中使用能非特異性地滲入DNA雙鏈中發(fā)生熒光信號的SYBR Green染料,因此在實驗中要避免產(chǎn)生非特異性擴增與引物二聚體。所采用的三對特異性引物(psbA、psbD和18S rRNA的引物)均使用陳張帆[13]已被證實的引物。實驗數(shù)據(jù)處理上采用了相對定量法,有效降低了各種誤差。

有關(guān)缺水對高等植物光合作用影響的研究已經(jīng)比較深入。早期有研究表明,PSⅡ?qū)γ撍踔潦禽p微脫水都很敏感,嚴(yán)重時會發(fā)生損傷[15]。但也有研究指出,PSⅡ甚至整個光合作用復(fù)合體可以積極抵御缺水脅迫[16-17]。對于高等植物在水分脅迫下的psbA、psbD表達量的變化已有人研究。劉文娟等人對兩種小麥品種綿農(nóng)4號和5號的研究表明水分脅迫下,兩種小麥的 PSⅡ主要基因(psbA、psbD)的轉(zhuǎn)錄水平下降[18];Yuan Shu等[19]對大麥的研究結(jié)果也表明水分脅迫下,大麥的 PSⅡ主要基因(psbA、psbD)的轉(zhuǎn)錄水平會下降;He等[20]的研究結(jié)果表明,小麥(Triticum aestivumL.cv.Longchun No.10)的psbA、psbD在缺水情況下表達量降低是由于轉(zhuǎn)錄水平降低或者mRNA 的穩(wěn)定性降低;Collett等[21]發(fā)現(xiàn)Xerophyta humilis的psbR,ChlP,psbA和psbP基因在該植物脫水過程中分別呈現(xiàn)不同程度的轉(zhuǎn)錄水平上的表達量下降趨勢;Zhang等[22]的研究結(jié)果則表明沙漠植物Ammopiptanthus mongolicus在缺水的情況下的cab基因會下調(diào),但是psbA基因則沒有很大變化。對于高等植物缺水狀態(tài)下的光合作用的分子變化機制的研究不僅局限于此,但是有關(guān)潮間帶大型海藻對脫水的研究卻多在生理水平上,幾乎沒有深入到分子水平的相關(guān)研究。

本實驗用熒光定量PCR技術(shù)檢測了條斑紫菜葉狀體不同脫水復(fù)水階段中的psbA 基因(編碼 D1)和psbD基因(編碼D2)在轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達量的變化。選用脫水15 min,60 min,105 min(即對應(yīng)相對含水量為71%,34%,21%)分別代表輕微脫水、中度脫水和嚴(yán)重脫水 3個階段。結(jié)果表明在輕微脫水狀態(tài)下,psbA、psbD相對于18S rRNA (管家基因)的表達量呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(圖2)。這個研究結(jié)果與高等植物在脫水過程中的相應(yīng)研究結(jié)果相差甚遠,但是恰恰與之前本組實驗人員通過調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x研究的條斑紫菜在脫水過程中PSⅡ活性的變化趨勢相一致：即 PSⅡ活性在藻體輕度脫水狀態(tài)下反而比正常狀態(tài)下的略有升高,并且隨著脫水程度的加劇,其活性逐漸降低至接近于零(未發(fā)表資料)。根據(jù)這些實驗結(jié)果推測：由于條斑紫菜在輕度脫水時僅是藻體細胞表層水分蒸發(fā),使藻體細胞能夠更好的接觸到空氣中較多的 CO2,導(dǎo)致藻體本身需要更多的化學(xué)能來固定碳,因此形成反饋調(diào)節(jié)。為促使光反應(yīng)增強,編碼PSⅡ的中心蛋白的psbA、psbD基因會表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄水平以滿足其需求,從而導(dǎo)致了PSⅡ的活性出現(xiàn)暫時增強的現(xiàn)象。由此,作者推斷在輕度脫水狀態(tài)下psbA和psbD基因轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達量的快速增大可能是藻體暴露在空氣中時適應(yīng)陸地環(huán)境的初始響應(yīng)。而隨著脫水程度的加劇,細胞本身水分揮發(fā),沒有足夠的水進行正常的生命活動,光合作用的光化學(xué)反應(yīng)也沒有足夠的水以備裂解。表現(xiàn)為 PSⅡ的活性迅速降低,藻體本身不再需要大量的PSⅡ中心蛋白。因此,psbA、psbD基因會有較低的轉(zhuǎn)錄水平以減少物質(zhì)消耗而處于光合作用減弱甚至是休眠狀態(tài)。

然而,在測定PSⅡ的中心蛋白D1、D2的mRNA分子表達水平的變化時發(fā)現(xiàn),雖然psbA、psbD的相對表達量都呈現(xiàn)相同的變化趨勢,但增大的幅度卻相差很大(圖2)。Kapoor等[23]在水稻的生長發(fā)育過程中也發(fā)現(xiàn),雖然psbA和psbD基因的表達均增大,但是它們的增大倍數(shù)不同。這與本研究的結(jié)果一致,表明雖然D1蛋白和D2蛋白在PSⅡ反應(yīng)中心復(fù)合物中以同比例裝配,但是psbA和psbD基因的mRNA水平上的表達量變化幅度并不同步。此外,有關(guān)D1蛋白的研究表明,D1蛋白暴露于強光下或處于強光與環(huán)境脅迫相偶聯(lián)的環(huán)境時,其降解速率就會超過合成速率[24-25]。類囊體膜發(fā)生損傷時,D1蛋白開始周轉(zhuǎn),同時 PSⅡ伴隨著新合成的 D1蛋白的合成重新組裝。對藍藻Synechocystissp.PCC6803的研究表明,對蛋白合成過程中的表達步驟的控制是在高光強下PSⅡ光抑制的主要原因[26],而psbA基因的 mRNA的翻譯是D1蛋白合成的關(guān)鍵調(diào)控步驟[27-28],這使得研究psbA基因 mRNA的表達量具有更重要意義。條斑紫菜脫水過程中psbA基因轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達量高于psbD基因,可能是由于脫水過程導(dǎo)致 D1蛋白快速周轉(zhuǎn),因此需要大量的psbA基因的mRNA來支持D1蛋白的快速周轉(zhuǎn)。同時說明,對于不同的psbA和psbD基因的mRNA水平的相對表達量而言,二者的有效翻譯率或組裝率必定不同。

另外,有研究表明 Dl蛋白的合成還受 PSⅡ中其他蛋白質(zhì)協(xié)同表達的影響。在缺失psbD的Chlamydomonas reinhardtii中,盡管 D1蛋白的mRNA含量正常,但由于D2蛋白不能被合成,因此Dl蛋白也不存在[29];反之,在psbA失活的Syneehocystis6803的突變體中,Dl蛋白不能形成,D2蛋白也不積累[30]。即真正組裝的PSⅡ的中心蛋白的量是由相對含量較少的蛋白決定的。本實驗中,雖然在輕度(RWC 71%)和中度(RWC 34%)脫水狀態(tài)下psbA基因的相對表達量是psbD基因的相對表達量的2.29倍(P <0.05)和5倍(P <0.01),但psbD基因的相對表達量較低,因此認(rèn)為真正組裝的 PSⅡ的中心蛋白的量不是由psbA基因的mRNA決定,而是由psbD基因的 mRNA決定。有關(guān)引起psbA和psbD基因的表達量變化趨勢不一致的原因還有待進一步研究。

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