宋之明 張紹昆 孫 洋 任 琦 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院骨科，吉林 長春 300)

軟骨損傷較為常見，但由于軟骨缺乏血管分布和神經(jīng)支配，因而損傷后難以自身修復(fù)。目前臨床治療軟骨缺損的方法很多，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，利用軟骨細(xì)胞移植方法修復(fù)軟骨缺損的研究逐漸成為熱點(diǎn)〔1，2〕。但由于自體軟骨在體內(nèi)分布較少，可獲取的軟骨細(xì)胞數(shù)量有限;同時(shí)軟骨細(xì)胞的代謝和增殖能力低，體外長期培養(yǎng)易出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，難以保持軟骨細(xì)胞表型，因而獲取足夠數(shù)量和維持表型的自體軟骨細(xì)胞對于軟骨組織工程修復(fù)軟骨缺損具有重要的意義。胰島素樣生長因子I(Insulin-like growth factor-I，IGF-I)是軟骨形成和代謝中最重要的生長因子之一，體內(nèi)外的研究表明IGF-I能刺激軟骨細(xì)胞分裂增殖，并合成Ⅱ型膠原和蛋白多糖維持軟骨細(xì)胞的表型〔3～7〕。本研究利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法將具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和維持軟骨細(xì)胞表型作用的人IGF-I(hIGF-I)基因轉(zhuǎn)染兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，并檢測基因轉(zhuǎn)移后對軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為軟骨組織工程和基因治療軟骨缺損奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒 含有hIFG-I基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNC-IGFGFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級2周齡灰兔，雌雄不限，購自長春生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。

1.1.3 主要試劑 DMEM(高糖)培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院;胰蛋白酶購自Amresco公司;polybrene、G418均購自 Invitrogen公司;牛血清白蛋白、噻唑藍(lán)(MTT)!硫酸軟骨素、木瓜蛋白酶、Ⅱ型膠原酶和焦碳酸二乙酯(DEPC)均購自Sigma公司;二甲基亞甲藍(lán)購自Aldrich公司;小鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體購自NeoMarkers公司;兔抗人IGFI抗體、辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗小鼠多克隆抗體、鏈霉親和素-生物素-過氧化物復(fù)合物(SABC)免疫組織化學(xué)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;Trizol試劑購自Gibco公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) 出生2 w灰兔無菌條件下取股骨內(nèi)、外髁關(guān)節(jié)軟骨，用0.2%Ⅱ型膠原酶于37℃消化，1 500 r/min離心10 min，沉淀物加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸。臺(tái)盼藍(lán)記數(shù)，并檢查細(xì)胞活力，以活力達(dá)90%以上的細(xì)胞懸液按105個(gè)/ml的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后每隔4～5 d更換培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察形態(tài)變化，并行細(xì)胞染色鑒定。

1.2.2 軟骨細(xì)胞鑒定

1.2.2.1 甲苯胺藍(lán)染色 原代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞以2×105個(gè)/ml接種于預(yù)置有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞80%融合后，取出玻片，用預(yù)冷的丙酮固定細(xì)胞15 min，細(xì)胞爬片置于10 g/L的甲苯胺藍(lán)染液中染色過夜，體積分?jǐn)?shù)為95%酒精分色后，室溫下烘干封片。

1.2.2.2 Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將原代軟骨細(xì)胞接種于處理的蓋玻片上。細(xì)胞克隆爬片以4%多聚甲醛固定15 min，新鮮配制0.5%H2O2/甲醇室溫處理30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，進(jìn)行檢測。陽性對照用關(guān)節(jié)軟骨組織，陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的hIGF-I基因轉(zhuǎn)染兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞

1.2.3.1 G418對兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞最小致死劑量的測定 24孔板接種適量第2代軟骨細(xì)胞。細(xì)胞長成50%～60%匯合時(shí)，加入含有不同濃度 G418(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 g/L)的選擇培養(yǎng)液。2 w時(shí)根據(jù)細(xì)胞死亡情況確定G418對軟骨細(xì)胞的最小致死劑量。

1.2.3.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)hIGF-I(含有GFP)轉(zhuǎn)染兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及G418抗性細(xì)胞的篩選 感染前1 d取第2代軟骨細(xì)胞以2×104～6 ×104個(gè)/孔接種 24 孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。感染當(dāng)天移去培養(yǎng)液，加入低血清培養(yǎng)液(含病毒上清0.1 μl、1 μl和5 μl)，加入polybrene至終濃度4 μg/ml，37℃感染1～3 h后再次加入低血清培養(yǎng)液，將polybrene稀釋至2μg/ml，培養(yǎng)24 h后換成含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，72 h后換成最小致死劑量G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行抗性細(xì)胞篩選，2 w細(xì)胞克隆形成，其陽性克隆在G418維持劑量的壓力下繼續(xù)培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)移至96孔板，待細(xì)胞長滿板底再依次轉(zhuǎn)移至24孔板、6孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。

1.2.4 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的鑒定

1.2.4.1 RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞hIGF-I mRNA表達(dá)情況 分別用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染2 d、2 w、4 w和6 w的軟骨細(xì)胞總 RNA，按照 RT-PCR試劑盒說明書操作。hIGF-I(290 bp)引物序列為:上游5'-CATGTCCTCCTCGCATCTCT-3';下游5'-AGTGATTCCGCTCGAGCTAC-3'。內(nèi)參照為β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(540 bp)，引物序列為:上游 5'-TACAACCTCCTTGCAGCTCC-3';下游 5'-GGATCTTCATGAGGTAGTAGTG-3'。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95℃ 5 min;95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。產(chǎn)物以瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。取同時(shí)間點(diǎn)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。

1.2.4.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測 細(xì)胞克隆爬片以4%多聚甲醛(含1‰DEPC)固定15 min，新鮮配制0.5%H2O2/甲醇室溫處理30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測IGF-I。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。

1.2.4.3 綠色熒光蛋白在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)〔8〕熒光顯微鏡下紫外光激發(fā)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。

1.2.5 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染hIGF-I后細(xì)胞增殖能力的變化

1.2.5.1 MTT法檢測轉(zhuǎn)染的hIGF-I對軟骨細(xì)胞數(shù)量的影響

轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞克隆分別在第2天、第2周和第4周、第6周接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后加入5 mg/ml MTT溶液20μl，培養(yǎng)4 h后加入150μl DMSO溶解結(jié)晶物，測定490 nm處光吸收值(OD值)%以未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞為對照。

1.2.5.2 流式細(xì)胞儀檢測 轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞克隆制成單細(xì)胞懸液，4℃預(yù)冷的70%乙醇固定，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/ml，流式細(xì)胞儀檢測。以未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞為對照。

1.2.6 轉(zhuǎn)染hIGF-I后軟骨細(xì)胞表型的檢測

1.2.6.1 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 將轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞由6孔板按105個(gè)/ml密度轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后每隔2～3 d更換培養(yǎng)基，細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底后用0.25%胰酶傳代，倒置顯微鏡下觀察形態(tài)變化。

1.2.6.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá) 未轉(zhuǎn)染的第2代軟骨細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞分別接種于處理的蓋玻片上。細(xì)胞克隆爬片以4%多聚甲醛(含1‰ DEPC)固定15 min，新鮮配制0.5%H2O2/甲醇室溫處理30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，采用鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。陽性對照用關(guān)節(jié)軟骨組織，陰性對照用PBS代替一抗。

1.2.6.3 二甲基亞甲藍(lán)(DMB)法測細(xì)胞傳代消化液中硫酸糖胺多糖(GAG)含量 將軟骨細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染后第2天、2周、4周和6周接種至24孔板，至細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶(每孔0.25 ml)消化留測GAG含量。細(xì)胞消化液中加入木瓜蛋白酶溶液，在60℃水浴中消化60 min，取250μl上述孵化消化液加入2.5 ml DMB顯色劑，混勻，反應(yīng)15 s后，于525 nm波長處比色，測定吸光度，計(jì)算糖胺多糖含量(標(biāo)準(zhǔn)品為硫酸軟骨素)%

1.2.6.4 ELISA檢測細(xì)胞上清Ⅱ型膠原相對含量 將軟骨細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染后第2天、2周、4周和6周接種至24孔板，至細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，收集上清，參照ELISA試劑盒說明書檢測軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中Ⅱ型膠原表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0軟件，所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 成功分離的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種后呈球形懸浮狀態(tài)，折光性強(qiáng)，貼壁較慢，24～36 h貼壁，48 h開始伸展，細(xì)胞扁平，單層生長，外形呈梭形或多角形，可見核分裂相。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞體積增大，呈多邊形，可見細(xì)胞聚集成簇，長成一片時(shí)呈明顯的鋪路石狀外觀，與長梭形的成纖維細(xì)胞較易區(qū)分。傳代細(xì)胞形態(tài)與原代貼壁生長的細(xì)胞相似。細(xì)胞較大，扁平，呈三角形或多邊形，偶可見核分

裂相，胞漿中顆粒較多。軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)1～5代時(shí)，細(xì)胞周期為6 d左右。連續(xù)傳5代，軟骨細(xì)胞形態(tài)基本相同。5代以后，形態(tài)逐漸發(fā)生變化，表現(xiàn)為長梭形的成纖維樣細(xì)胞增多。見圖1。

2.2 軟骨細(xì)胞的鑒定 甲苯胺藍(lán)染色見細(xì)胞內(nèi)有大量藍(lán)紫色異染顆粒，Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示98%以上原代軟骨細(xì)胞質(zhì)中有紅棕色染色物質(zhì)，說明有Ⅱ型膠原表達(dá)，證明體外分離軟骨細(xì)胞培養(yǎng)成功。見圖2，圖3。

圖1 培養(yǎng)5代的軟骨細(xì)胞(×200)

圖2 軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色(×400)

圖3 Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色(×400)

2.3 G418對于兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的最小致死劑量的測定 加入G418后第4天，高濃度孔內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)死亡脫落現(xiàn)象;2 w時(shí)，0.3 g/L濃度孔內(nèi)可見有少數(shù)細(xì)胞存活生長，0.4 g/L及以上濃度孔內(nèi)均無細(xì)胞生長。因此，G418對軟骨細(xì)胞的最小致死劑量為0.4 g/L。

2.4 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的篩選和鑒定

2.4.1 G418抗性軟骨細(xì)胞的篩選 轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞經(jīng)0.4 g/L G418篩選，2 w后得到抗G418的陽性細(xì)胞克隆，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含G418的培養(yǎng)液中逐漸全部死亡，初步證明hIGF-I基因轉(zhuǎn)染成功。

2.4.2 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞hIGF-I mRNA表達(dá)情況 RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，hIGF-I基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)為陽性，在未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)為陰性。見圖4。

2.4.3 細(xì)胞免疫組化檢測 在轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色顆粒樣陽性信號(hào)，表示hIGF-I蛋白表達(dá)陽性，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞染色為陰性，證明hIGF-I基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞成功。見圖5。

2.4.4 綠色熒光蛋白在軟骨細(xì)胞中的表達(dá) 在熒光顯微鏡下，pLNC-IGF-GFP轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞紫外光可激發(fā)出綠色熒光，未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞未見綠色熒光。見圖6。

2.5 轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞增殖能力變化

2.5.1 MTT法檢測結(jié)果 在轉(zhuǎn)染后第2天、第2周、第4周、第6周軟骨細(xì)胞的增殖能力均明顯高于未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞(P＜0.05)%轉(zhuǎn)染后的軟骨細(xì)胞第6周時(shí)的增殖能力與未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞第2周的增殖能力無明顯差別。見表1。

2.5.2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 與未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染hIGF-I的軟骨細(xì)胞S期細(xì)胞數(shù)目明顯增加，G1期細(xì)胞數(shù)目明顯下降，差異均有顯著性(P＜0.05)，G2期細(xì)胞數(shù)目也有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

圖4 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞RT-PCR檢測

表1 MTT法檢測轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞增殖能力(±s)

表1 MTT法檢測轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞增殖能力(±s)

與同時(shí)間點(diǎn)未轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞比較:1)P＜0.05，下表同

?

表2 軟骨細(xì)胞的細(xì)胞周期分布(±s，%)

表2 軟骨細(xì)胞的細(xì)胞周期分布(±s，%)

組別 G1期 S期 G2期未轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞52.43±7.13 39.57±5.36 8.00±2.49轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞 40.08±5.761) 54.57±5.071)5.35±2.15

2.6 轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞表型的檢測

2.6.1 轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 形態(tài)同傳代未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞，但細(xì)胞周期較未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞短，約為4～5 d左右。連續(xù)傳7代，軟骨細(xì)胞形態(tài)基本相同。第8代細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生變化，反分化的軟骨細(xì)胞增多。

2.6.2 Ⅱ型膠原免疫組化檢測 在轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞質(zhì)中有紅棕色異染信號(hào)，表示軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)分泌Ⅱ型膠原，沒有失去軟骨細(xì)胞原有表型。見圖7。

圖5 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞免疫組化染色(×400)

圖6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞GFP表達(dá)(×200)

圖7 Ⅱ型膠原免疫組化染色(×400)

2.6.3 Ⅱ型膠原ELISA檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染IGF-I的軟骨細(xì)胞在2 d、2 w、4 w、6 w時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中Ⅱ型膠原的表達(dá)均高于未轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞(P＜0.05)，其中轉(zhuǎn)染后的軟骨細(xì)胞在6 w時(shí)Ⅱ型膠原仍有較高水平的表達(dá)。見表3。

2.6.4 GAG含量測定 轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞合成GAG的能力明顯增強(qiáng)，均高于同時(shí)間點(diǎn)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，差異具有顯著性意義(P＜0.05)%見表4。

表3 Ⅱ型膠原ELISA檢測相對含量(±s，n=6)

表3 Ⅱ型膠原ELISA檢測相對含量(±s，n=6)

組別2 d 2 w 4 w 6 w未轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞 0.495±0.102 0.412±0.121 0.267±0.08 0.103±0.037轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞 0.747±0.1191)0.65±0.1681)0.563±0.1531)0.416±0.0811)

表4 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的GAG含量(±s，n=6，μg/cm2)

表4 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的GAG含量(±s，n=6，μg/cm2)

組別2 d 2 w 4 w 6 w未轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞 54.65±2.69 38.53±2.15 22.51±3.20 14.51±2.24轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞 81.94±2.381)68.4±5.641)54.44±4.261)36.68±5.31)

3 討論

軟骨缺損的治療一直是臨床棘手難題。近年來，隨著生長因子在軟骨代謝和修復(fù)中重要作用的發(fā)現(xiàn)，人們將其應(yīng)用于軟骨損傷局部，以促進(jìn)軟骨損傷愈合，獲得了良好的效果。在這些已發(fā)現(xiàn)的生長因子中，IGF-I由于可以刺激關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖的合成、軟骨細(xì)胞的分裂增殖和Ⅱ型膠原合成，故越來越受到關(guān)注。但是局部應(yīng)用生長因子治療軟骨缺損仍存在很多缺點(diǎn)，如半衰期短、需反復(fù)使用、價(jià)格較貴等，影響其臨床應(yīng)用價(jià)值。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們可以利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將生長因子基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞植入損傷處以促進(jìn)修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)分離并鑒定了兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，以hlGF-I cDNA為目的基因，以兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為靶細(xì)胞，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，通過對轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的篩選鑒定，證明了hlGF-I在軟骨細(xì)胞內(nèi)可以得到穩(wěn)定表達(dá)，又通過檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的軟骨細(xì)胞MTT法測定的OD值增加，流式細(xì)胞儀檢測顯示S期細(xì)胞比例上升，軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)增多，GAG含量提高，說明hIGF-I基因轉(zhuǎn)移能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖，并維持軟骨細(xì)胞表型，為進(jìn)一步研究軟骨組織工程和基因治療軟骨缺損奠定了基礎(chǔ)。

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