沈念原，王秀芹(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

高效液相色譜法測定葡萄酒中生物胺的含量

沈念原，王秀芹*(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083)

葡萄酒是經(jīng)過發(fā)酵而制成的，很容易存在生物胺，對人體可能存在危害，因此本文檢測了幾種葡萄酒中甲胺、乙胺、色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺的含量。實(shí)驗(yàn)選用高效液相色譜儀，紫外檢測器，0.1mol/L鹽酸溶液提取，丹磺酰氯衍生化的方法進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此法相關(guān)系數(shù)大于99.8%，最低檢測限在0.55～1.03μg/L，回收率大于95%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在6.33%以下。實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測出葡萄酒中甲胺含量為5.53±0.028～6.67±0.04mg/L，乙胺含量為5.41±0.07～6.99±0.19mg/L，色胺含量為10.35±0.068～14.18±0.42mg/L，腐胺含量為9.10±0.28～11.75±0.49mg/L，均在安全標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，可安全食用。

高效液相色譜，生物胺，葡萄酒

生物胺是一類主要由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的弱堿性低分子量含氮化合物，常存在于動植物體內(nèi)及微生物體內(nèi)。生物胺不僅是生成荷爾蒙、核酸、蛋白質(zhì)等的前體物質(zhì)，也是生成致癌物質(zhì)和亞硝基化合物的前體物質(zhì)［1］。微量生物胺是生物體(包括人體)內(nèi)的正?；钚猿煞郑?，人體攝入過多的生物胺并進(jìn)入血液中，易產(chǎn)生頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化等不良癥狀［2］。食品中常見的生物胺主要包括脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等)、芳香族(酪胺、苯乙胺等)和雜環(huán)族(組胺、色胺等)生物胺［3］。生物胺存在于多種食品尤其是發(fā)酵食品中。生物胺中組胺對人類健康的影響最大，其次是酪胺［4］。200～800mg酪胺可引發(fā)輕微的血壓升高，在酒精飲料中酪胺的上限為10g/mL［5］。發(fā)酵食品中允許的組胺含量范圍是 50～100mg/kg，酪胺為 100～800mg/kg，苯乙胺為30mg/kg，食品中組胺的上限為100mg/kg，酒精飲料中的上限為20mg/kg，而每餐攝入40mg生物胺就被認(rèn)為是潛在的危險(xiǎn)［5］。酪胺 、苯乙胺和色胺等毒性較大，已有研究表明，苯乙胺和酪胺有升壓作用，組胺有降壓作用，色胺則具肝毒性，還能引起人血壓升高，造成高血壓，但現(xiàn)在很多國家尚未提出色胺的最大允許量［6］。目前已有多種方法應(yīng)用于食品中生物胺的測定，如電化學(xué)生物傳感器法、薄層色譜法、氣相色譜法、離子色譜法和反相高效液相色譜法等［7］。HPLC具有分析速度快、柱效高、檢測靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確的特點(diǎn)，是目前食品中生物胺含量分析測定的主要手段。

表1 HPLC法檢測生物胺的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)方程、相關(guān)系數(shù)、最低檢出限(n=3)

表2 八種生物胺的回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄酒樣 購于本地超市，三種葡萄酒，每種酒樣購買三瓶，共9瓶;甲胺、乙胺、色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、丹磺酰氯 購于Sigma公司;乙腈 色譜純;氨水、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉 均為分析純;娃哈哈純凈水。

WATERS高效液相色譜儀(HPLC)，Waters－Atlantisd C18色譜柱(4.6×250mm，ID，5μm)，UV/VIS探測器，泵，針筒式濾器(5mL)，微孔濾膜(0.45μm，25mm)，數(shù)顯恒溫水浴鍋，分析天平。

1.2 色譜條件

選用WATERS高效液相色譜儀(HPLC)，Waters－Atlantisd C18色譜柱(4.6×250mm，ID，5μm)，UV/VIS探測器，檢測波長為254nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20μL，流動相為:乙腈∶水，比例為65∶35，v/v。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣10.0～18.0mg，用0.1mol/L HCl溶液溶解并轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，定容至刻度，封口，在黑暗中4℃保存。使用前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將此標(biāo)準(zhǔn)儲備液用0.1mol/L HCl溶液稀釋成1.78、2.37、3.55、7.11、35.55mg/L等五種不同梯度的溶液，進(jìn)行RP－HPLC分析。

1.4 衍生過程

1mL樣品與碳酸氫鈉飽和溶液(200μL)，2mol/L NaOH(20μL)，2mL丹磺酰氯(10mg溶于1mL丙酮中)混合，混合液在70℃中水浴10min，反應(yīng)后，加入1mL氨水(1mL水中溶解50mg氨水)使反應(yīng)終止［8］。10min后，放入離心機(jī)中(3000r/min)離心10min，上清液用0.45μm濾膜過濾，濾液可直接進(jìn)HPLC測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)樣測定

八種生物胺在本文的色譜條件下都能在35min內(nèi)分離出來，并且峰形效果良好。分離時(shí)間分別為:甲胺4.6min，乙胺5.4min，色胺7.2min，腐胺9.9min，尸胺11.3min，組胺13.3min，酪胺24.5min，亞精胺29.9min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度為1.78、2.37、3.55、7.11、35.55mg/L的溶液，衍生化后進(jìn)HPLC進(jìn)行測定，每種濃度平行測定3次，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方程、相關(guān)系數(shù)以及最低檢出限(LOD)。八種生物胺都呈線性關(guān)系，其中乙胺的相關(guān)系數(shù)為0.9998，組胺的相關(guān)系數(shù)為0.9982，且所有生物胺的相關(guān)系數(shù)都大于0.9982。以信噪比(S/N)為3進(jìn)行最低檢出限的檢測，所得最低檢出限為0.55～1.03μg/L，表明這八種生物胺的靈敏度都比較高，該方法能夠檢出含量較低的生物胺(表1)。

2.3 回收率的測定

向酒樣中添加濃度分別為2.5、5.0、10.0mg/L的生物胺標(biāo)樣，每種添加樣平行測定三次，選用外標(biāo)法進(jìn)行測定，所得結(jié)果見表2。平均回收率最低為乙胺:95.37%，最高為甲胺:103.37%，回收率在95%～104%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～6.33%之間，說明該方法重復(fù)性良好，測定結(jié)果較為準(zhǔn)確(表2)。

2.4 葡萄酒中生物胺含量的測定

通過HPLC法對9瓶葡萄酒進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)所有樣品中均沒有尸胺、組胺、酪胺、亞精胺，甲胺、乙胺、腐胺、色胺為葡萄酒中主要生物胺。酒樣3中甲胺和色胺含量比其他兩種酒樣含量分別低17.5%、23.9%(P≤0.05)，酒樣2中乙胺含量最低，平均為5.83mg/L，腐胺含量在三種酒樣中含量差別不大。每個品牌的三瓶葡萄酒中四種生物胺含量差別不大，除了腐胺在酒樣3中含量比同樣品牌的其他兩瓶高出27.0%和28.6%(P≤0.05)。甲胺含量為5.53±0.028～6.67±0.04mg/L;乙胺含量為5.41±0.07～6.99±0.19mg/L;色胺含量為10.35±0.068～14.18±0.42mg/L;腐胺含量為9.10±0.28～11.75±0.49mg/L。色胺在三種酒中含量最高，其次為腐胺。三種酒的生物胺總含量變化不大，為31.81～36.72mg/L。酒樣3中生物胺總含量最低，其次為酒樣1，最高的是酒樣2(表3)。

表3 葡萄酒中生物胺的含量(mg/L)

由于生物胺存在潛在的毒性，并且存在于大量的食物中，因而近年來一直被人們廣泛研究。Kirschbaum等發(fā)現(xiàn)魚醬里含有很高的酪胺、腐胺、色胺和組胺［9］。蝦醬中普遍含有腐胺，相對來說，肉類、果汁和罐裝蔬菜水果中的生物胺含量比較低［8］。本研究中的葡萄酒生物胺含量均未超標(biāo)［10］。紅葡萄酒釀造法是將葡萄果皮、果肉一起壓榨而制成的，因此葡萄中的腐胺必然存在于葡萄酒中，在釀造過程中，腐胺可以源于鳥氨酸微生物脫羧，也可以是瓜氨酸或者是精氨酸等氨基酸的微生物新陳代謝;腐胺還可以通過精氨酸形成的胍丁胺生成。以上這些途徑，是在幾種紅酒的蘋果乳酸發(fā)酵過程中生成的乳酸細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的［11－12］，因此可以說明腐胺在葡萄酒中含量較高的原因。目前還沒有葡萄酒中生物胺含量最大值的法律規(guī)定，但是酒精飲料中認(rèn)為2～10mg/mL的組胺，10～80mg/L的酪胺，3mg/L的2－苯乙胺為有毒的界限［10，13］。不是所有生物胺都有同樣的毒性，一般組胺、酪胺和苯乙胺是人們所關(guān)注的。

3 結(jié)論

本研究選用0.1mol/L鹽酸溶液進(jìn)行提取，經(jīng)丹磺酰氯衍生化后進(jìn)入HPLC進(jìn)行測定。該方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)都達(dá)到99%以上，回收率在95%以上，最低檢測限為0.55～1.03μg/L，說明該方法方便快捷，穩(wěn)定性和重復(fù)性都很好，能夠快速準(zhǔn)確地測定出葡萄酒中生物胺的含量。

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Determination of biogenic amines in wine by high performance liquid chromatography

SHEN Nian－yuan，WANG Xiu－qin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Wine is easy to exist biogenic amines after fermentation and they may be harmful to humans.So this research studied methylamine，ethylamine，tryptamine，putrescine，cadaverine，histamine，tyramine，and spermidine in several kinds of wine.The method involved extraction with 0.1mol/L HCl solution，pre－column derivatization of the amines with dansyl chloride and subsequent analysis by high－performance liquid chromatography with UV detection.The results showed that the correlation coefficients were greater than 99.8%，the limit of detection was from 0.55μg/L to 1.03μg/L，recovery was more than 95%，relative standard deviations were below 6.33%.Levels of methylamine ethylamine tryptamine putrescine were 5.53±0.028～6.67±0.04mg/L，5.41±0.07～6.99±0.19mg/L，10.35±0.068～14.18±0.42mg/L，9.10±0.28～11.75±0.49mg/L，respectively.The results were in the safety standards and the wine could be safe to consume.

high performance liquid chromatography;biogenic amines;wine

TS207.3

A

1002－0306(2011)04－0394－03

2010－03－21 *通訊聯(lián)系人

沈念原(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:葡萄酒化學(xué)與釀造。