朱志鵬，劉慧玲，吳可鑫，虞健翔，王博文，孫 淼,2*

(1 江蘇省鹽土生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鹽城師范學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城 224002；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，作物遺傳與種質(zhì)改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

秋葵[Abelmoschusesculentus(L.) Moench]為錦葵科(Malvaceae)秋葵屬(AbelmoschusMedicus)，又稱黃秋葵，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，具有觀賞價(jià)值、食用價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。秋葵的莖為圓柱形，疏生散刺；其葉呈掌狀，裂片闊至狹，托葉線形，被疏硬毛；其蒴果為筒狀尖塔形。秋葵性喜暖，耐熱力強(qiáng)，多生長(zhǎng)于熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]。秋葵中含豐富的鉀、鈣、鐵、鋅、錳等元素，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，已逐漸成為一種新型蔬菜；它還具有果膠類物質(zhì)、膳纖維、酚類化合物等多種生物活性物質(zhì)，可以有效防治心血管疾病、消化疾病等[3]。

植物在自然生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)面對(duì)各種生物或非生物脅迫影響，面對(duì)這些逆境條件，植物體內(nèi)通常會(huì)通過一系列的生理、生化反應(yīng)作為自身的防御保護(hù)措施[4]。在植物逆境響應(yīng)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄因子對(duì)功能基因表達(dá)的調(diào)控是植物逆境響應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。MYB基因家族是與生理代謝、細(xì)胞的形態(tài)和模式建成等生理過程有關(guān)的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與了植物器官的生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)非生物脅迫的特異性響應(yīng)[5]。迄今為止，研究者已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]、棉花(GossypiumhirsutumL.)[7]、大豆(GlycinemaxL.)[8]、漆樹(Toxicodendronvernicifluum)[9]等多種植物中擴(kuò)增獲得MYB類基因，且過度表達(dá)MYB基因的擬南芥[10]、番茄(SolanumlycopersicumL.)[11]等均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的非生物脅迫抗性。但秋葵MYB基因的功能研究尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究以‘北海道1號(hào)’秋葵為實(shí)驗(yàn)材料，擴(kuò)增獲得了1個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因AeMYB1R1，基于生物信息學(xué)技術(shù)分析其核苷酸序列和編碼的氨基酸序列。并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析了AeMYB1R1基因在秋葵不同器官(葉、莖、根)和非生物脅迫(低溫、干旱、鹽和高溫脅迫)中的表達(dá)特異性，為進(jìn)一步開展秋葵MYB類轉(zhuǎn)錄因子的分子調(diào)控機(jī)制研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)研究對(duì)象為秋葵(圖1)品種‘北海道1號(hào)’(A.esculentus, cv ‘Hokkaido No.1’)，待秋葵幼苗長(zhǎng)至三葉一心時(shí)移入培養(yǎng)箱進(jìn)行脅迫處理。脅迫處理試驗(yàn)分為4組，分別為38 ℃的高溫脅迫處理(A組)，200 mmol/L NaCl溶液的鹽脅迫處理(B組)，200 g/L PEG6000溶液的干旱脅迫處理(C組)和-7 ℃低溫脅迫處理(D組)，每組6株用于采樣，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在處理6、12和24 h時(shí)分別取秋葵相同位置的葉、莖、根等組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 方 法

1.2.1 RNA的提取與cDNA的合成使用RNA提取試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit試劑盒，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，目錄號(hào)：DP419)分別提取秋葵的不同時(shí)期和不同組織的Total RNA，提取完成后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒，購(gòu)自北京TaKaRa生物醫(yī)藥科技有限公司，目錄號(hào)：RR036A)的使用說明，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 秋葵AeMYB1R1基因克隆根據(jù)本課題組上傳的秋葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI登錄號(hào)：SRR13983395)[12]，檢索獲得編碼秋葵MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因AeMYB1R1 (GenBank登錄號(hào)：OM963000)，利用DNAMAN設(shè)計(jì)1對(duì)引物(正向引物：5′-CTGCGGAGGAGTGAAACTGT-3′，反向引物：5′-TCTCACCGCGATGATTAGCC-3′)。以反轉(zhuǎn)錄得

到的cDNA為模板，使用20 μL體系(PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 10.0 μL，cDNA 1.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，ddH2O 7.0 μL)進(jìn)行AeMYB1R1基因PCR擴(kuò)增(高保真PCR酶購(gòu)自北京TaKaRa生物醫(yī)藥科技有限公司，目錄號(hào)R045A)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性10 s，98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.2 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.3AeMYB1R1基因的生物信息學(xué)分析采用ExPASy-Translatetool可對(duì)AeMYB1R1核酸序列進(jìn)行翻譯，將AeMYB1R1基因序列翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列。使用ExPASy-Protparamtool分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。信號(hào)肽分析利用SignalP 5.0 Server軟件完成，跨膜結(jié)構(gòu)分析利用TMHMM Server v.2.0軟件完成。通過NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST對(duì)比，得到AeMYB1R1蛋白的保守域以及其他物種MYB蛋白的氨基酸序列。選用SOPMA軟件進(jìn)一步分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型由Swiss-Model在線建立。DNAMAN 6.0軟件被用于物種間MYB蛋白的多重對(duì)比和AeMYB1R1蛋白的親/疏水性分析。AeMYB1R1蛋白糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)采用NetOGlyc軟件。使用Netphos3.1 Server PredictProtein對(duì)AeMYB1R1蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析。使用Plant CARE識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別并特異結(jié)合的目標(biāo)基因旁側(cè)的DNA序列(順式作用元件)。本研究所用生物信息學(xué)分析在線網(wǎng)址及軟件如表1所示。

表1 生物信息學(xué)分析在線網(wǎng)址及軟件Table 1 Bioinformatics analysis online URL and software

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)基于PCR擴(kuò)增且經(jīng)過測(cè)序分析的AeMYB1R1基因序列，設(shè)計(jì)qRT-PCR熒光定量引物，AeMYB1R1基因表達(dá)正向引物為5′-CTGCGGAGGAGTGAAACTGT-3′，反向引物為5′-TCTCACCGCGATGATTAGCC-3′。以秋葵AeActin7為內(nèi)參基因，正向引物為5′-TCGCAGACCGTATGAGCAAG-3′，反向引物為5′-GGTGCTGAGTGATGCCAAGA-3′。使用qRT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)分析該基因在不同組織中和不同非生物脅迫下的表達(dá)情況。反應(yīng)體系20 μL，包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0 μL，cDNA 2.0 μL，正、反向引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，ddH2O 6.0 μL(TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自北京TaKaRa生物醫(yī)藥科技有限公司)。使用GraphPad Prism 8.0軟件，采用2-ΔΔCt方法對(duì)‘北海道1號(hào)’秋葵AeMYB1R1基因在不同器官和不同脅迫條件下的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋葵AeMYB1R1基因的克隆及序列分析

對(duì)AeMYB1R1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，得到一條長(zhǎng)約 1 100 bp 長(zhǎng)度的目的條帶(圖2)，目的片段大小基本符合預(yù)期。本研究從‘北海道1號(hào)’秋葵中克隆得到AeMYB1R1基因，結(jié)果顯示AeMYB1R1基因的開放閱讀框(open reading frame, ORF)長(zhǎng)度為 1 056 bp，編碼352個(gè)氨基酸(圖3)。

2.2 AeMYB1R1蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)

ExPASy-Protparamtool對(duì)AeMYB1R1蛋白序列和理化性質(zhì)分析表明，其分子量為37 891.57 Da，理論等電點(diǎn)為8.75，分子式為C1647H2615N489O515S12，總原子數(shù)為5 278，脂肪指數(shù)為70.37，總平均親水性為-0.495，不穩(wěn)定指數(shù)(The instability index Ⅱ)為40.22。根據(jù)不穩(wěn)定指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)指數(shù)<40時(shí)為穩(wěn)定蛋白,指數(shù)>40時(shí)為不穩(wěn)定蛋白，因此由不穩(wěn)定性指數(shù)可判定AeMYB1R1蛋白為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)[13]。在堿基組成方面，AeMYB1R1基因序列由A、C、G、T四種堿基組成，其中含量占比最高的為腺嘌呤A，其數(shù)量為306，占比29.0%；胞嘧啶C的數(shù)量為254，占比24.1%；胸腺嘧啶T的數(shù)量為250，占比23.7%；鳥嘌呤G的數(shù)量為246，其占比為23.3%。表2顯示，在氨基酸組成方面，組成AeMYB1R1蛋白的20種氨基酸中絲氨酸(Ser)含量最高，色氨酸(Trp)數(shù)量最少，包括其中帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)32個(gè)以及帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)36個(gè)。

表2 AeMYB1R1蛋白中的20種氨基酸含量表Table 2 The list of 20 amino acids in AeMYB1R1 protein

2.3 AeMYB1R1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

NCBI-CDD在線工具分析結(jié)果顯示，AeMYB1R1的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?04～156位氨基酸的序列區(qū)域，特定匹配(Specific hits)得分最高的是myb_SHAQKYF，該匹配所屬SANT超家族(SANT superfamilies)，而SHAQKYF類MYB家族轉(zhuǎn)錄因子(域架構(gòu)ID 10019308)在植物的發(fā)育過程和防御反應(yīng)中起著核心作用。

利用NCBI在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索木槿(Hibiscussyriacus)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、榴蓮(Duriozibethinus)、可可(Theobromacacao)等19種植物的MYB1R1氨基酸序列，將其與秋葵AeMYB1R1氨基酸序列共同導(dǎo)入MEGA-X進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果(圖4)表明，AeMYB1R1的氨基酸序列與其他物種中MYB1R1的氨基酸相似度均超過65%，具有較高的一致性，說明MYB1R1在不同植物物種間的保守性較高。

2.4 AeMYB1R1蛋白結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)及其跨膜結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA對(duì)AeMYB1R1蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，AeMYB1R1編碼蛋白由α-螺旋、延伸主鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲4種結(jié)構(gòu)組成，分別占比為21.31%、9.94%、2.27%和66.48%。其中，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是AeMYB1R1主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5，A)。Swiss-Model對(duì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析結(jié)果與二級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)果基本相符(圖5，B)。以Entamoeba histolytica EhMybS3(SMTL ID:6nvz.1)為模板，所構(gòu)建的模型與其序列一致性為41%，覆蓋率為15%，氨基酸序列范圍為104～158。

對(duì)AeMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析未發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)果，推測(cè)AeMYB1R1蛋白序列中沒有信號(hào)肽的存在，推斷該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。TMHMM Server v.2.0分析結(jié)果顯示，AeMYB1R1蛋白的1～352位氨基酸均位于細(xì)胞膜表面，無跨膜螺旋區(qū)。氨基酸序列不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽，推測(cè)該蛋白屬于定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或細(xì)胞器基質(zhì)中的蛋白，不屬于膜蛋白或分泌蛋白。

2.5 AeMYB1R1氨基酸序列的親/疏水性預(yù)測(cè)

AeMYB1R1蛋白的親/疏水性分析結(jié)果表明，在AeMYB1R1蛋白的親水性區(qū)域(圖6，A)，第163位賴氨酸(Lys)的親水性最強(qiáng)；在AeMYB1R1蛋白的疏水性區(qū)域(圖6，B)，第118位亮氨酸(Leu)的疏水性最強(qiáng)。組成AeMYB1R1蛋白的氨基酸中，35%為親水性氨基酸，65%為疏水性氨基酸，AeMYB1R1蛋白的疏水區(qū)域多于親水區(qū)域，因此推測(cè)其屬于疏水性蛋白。

2.6 AeMYB1R1蛋白的修飾位點(diǎn)

2.6.1 AeMYB1R1蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果表明(圖7)，AeMYB1R1蛋白中共發(fā)現(xiàn)86處可能存在的磷酸化位點(diǎn)以及47個(gè)特異性激酶位點(diǎn)，包含了31個(gè)絲氨酸(Ser)、14個(gè)蘇氨酸(Thr)和2個(gè)酪氨酸(Tyr)。同時(shí)，AeMYB1R1蛋白涉及到13種特異性激酶，包括以鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC，以環(huán)腺苷酸依賴的蛋白激酶PKA，環(huán)鳥苷酸依賴的蛋白激酶PKG，以及作用于下游的磷酸化級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的p38MAPK、cdc2、cdk5，還包括DNA依賴性蛋白激酶DNAPK，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的糖原合成酶激酶-3(GSK-3)，參與信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白激酶核糖體S6激酶(RSK)，酪蛋白激酶1、2(CKI、CKII)，以及其他植物蛋白激酶INSR、ATM。

2.6.2 AeMYB1R1蛋白的糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)采用在線網(wǎng)站YinOYang 1.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)，本研究對(duì)AeMYB1R1蛋白潛在的O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，氨基酸序列的第2、52、58、59、60位等共19處O-糖基化位點(diǎn)，其中位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的氨基酸分別為6個(gè)蘇氨酸(Thr)和13個(gè)絲氨酸(Ser)(圖8，A)。NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)在線工具主要預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)，分析結(jié)果表明，第50、158、208、340位含有潛在的N-糖基化位點(diǎn)，但此序列不包含信號(hào)肽，無信號(hào)肽的蛋白質(zhì)不可能暴露在N-糖基化機(jī)制中，也不可能在體內(nèi)被糖基化(圖8，B)。

2.7 AeMYB1R1蛋白的同源性分析

利用MEGA-X對(duì)秋葵和其他20種植物的MYBs構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其同源進(jìn)化關(guān)系(圖9)。結(jié)果表明，AeMYB1R1與同屬于錦葵科(Malvaceae)的木槿(Hibiscussyriacus)和陸地棉(Gossypiumhirsutum)等植物的MYB蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，與木棉科(Bombacaceae)的榴蓮(Duriozibethinus)、梧桐科(Sterculiaceae)的可可(Theobromacacao)等植物有著近緣關(guān)系，而與茄科(Solanaceae)、蕓香科(Rutaceae)、葡萄科(Vitaceae)、豆科(Leguminosae)、胡桃科(Juglandaceae)等植物MYB1R1蛋白的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，同屬錦葵科的秋葵、木槿、陸地棉、可可等植物中的MYB1R1蛋白在進(jìn)化中更為保守。

2.8 AeMYB1R1在秋葵不同組織中的表達(dá)

通過qRT-PCR檢測(cè)分析‘北海道1號(hào)’秋葵AeMYB1R1基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果(圖10)顯示，AeMYB1R1基因在‘北海道1號(hào)’秋葵的葉片、莖部和根部都有不同程度的表達(dá)，在葉部表達(dá)量最高，其次是根部，而在莖部的表達(dá)水平最低。其中，秋葵葉部AeMYB1R1基因的表達(dá)水平是莖的21.23倍，是根部的7.95倍。

2.9 在非生物脅迫下AeMYB1R1的表達(dá)特性

通過順式作用元件分析，在AeMYB1R1序列中預(yù)測(cè)到了CGTCA-motif(茉莉酸甲酯響應(yīng)元件)、ABRE(脫落酸響應(yīng)元件)、MBS(干旱響應(yīng)元件)、G-box(光響應(yīng)元件)等多個(gè)與植物激素和逆境脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件，表明該基因可能在秋葵響應(yīng)非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制發(fā)揮作用。

進(jìn)一步通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，‘北海道1號(hào)’秋葵AeMYB1R1基因在高溫脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫和低溫脅迫下具有表達(dá)特異性(圖11)，在秋葵不同組織和不同處理時(shí)間相對(duì)表達(dá)水平存在明顯差異。

高溫(38 ℃)脅迫數(shù)據(jù)表明(圖11，A)，高溫處理6 h時(shí)，AeMYB1R1基因在秋葵葉片相對(duì)表達(dá)水平最高，分別為莖的7.64倍、根的1.45倍；處理12 h，AeMYB1R1基因在葉片中的表達(dá)量有略微增加，

而在莖部和根部的表達(dá)量顯著提高，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對(duì)表達(dá)量分別提高了15.48%、83.34%和110.34%；處理24 h，AeMYB1R1基因相對(duì)表達(dá)量在葉、莖、根中均有顯著提高，相較于6 h，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對(duì)表達(dá)量則分別提高了2.69、3.50和3.28倍。

鹽(200 mmol/L NaCl溶液)脅迫試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明(圖11，B)，鹽處理6 h，AeMYB1R1基因在葉中的表達(dá)量分別為莖的5.03倍、根的29.80倍；處理12 h時(shí)，AeMYB1R1基因的相對(duì)表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對(duì)表達(dá)量分別提高了1.46、8.45和26.33倍；處理24 h，AeMYB1R1基因在葉和根部的相對(duì)表達(dá)量明顯提升，并在根部顯著表達(dá)，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對(duì)表達(dá)量分別提高了14.85、10.38和1 339.17倍。

干旱(20% PEG6000溶液)脅迫試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明(圖11，C)，處理6 h時(shí)，AeMYB1R1基因在秋葵的葉、莖和根部的相對(duì)表達(dá)水平較低，且無顯著差異；干旱脅迫12 h時(shí)，AeMYB1R1的相對(duì)表達(dá)水平開始上升，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對(duì)表達(dá)量分別提高了99.20%、400.14%和160.12%；干旱脅迫24 h，AeMYB1R1基因在秋葵的葉片和根部的表達(dá)量提升較快，且在根部相對(duì)表達(dá)量最高，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對(duì)表達(dá)量分別提高了9.38、12.08和125.96倍。

低溫(-7 ℃)脅迫試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明(圖11，D)，低溫處理6和12 h時(shí)，AeMYB1R1基因在秋葵的葉、莖和根部的相對(duì)表達(dá)水平緩慢提高，未出現(xiàn)顯著變化；24 h時(shí)，AeMYB1R1基因在秋葵的葉、莖和根部的相對(duì)表達(dá)量提高較為顯著，相比于12 h時(shí)，AeMYB1R1基因在秋葵的葉、莖和根部分別提高了5.43、7.21和2.77倍。

3 討 論

非生物脅迫可通過破壞系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能影響滲透調(diào)控和離子平衡等，直接或間接地?fù)p害植物細(xì)胞，從而嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[14]。據(jù)報(bào)道，植物體內(nèi)主要存在5類與抗逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它們精準(zhǔn)地調(diào)控下游功能基因適時(shí)適量表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答，包括NAC、MYB、WRKY、bZIP和ERF/DREB[15]。其中，MYBs成員眾多，分布廣泛，參與植物次生代謝、激素轉(zhuǎn)導(dǎo)和環(huán)境因子反應(yīng)，并在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期和葉片形態(tài)發(fā)生中起著重要的調(diào)節(jié)作用[16]。本研究從‘北海道1號(hào)’秋葵中擴(kuò)增獲得了1個(gè)AeMYB1R1基因，其氨基酸序列具有較高的保守性。同時(shí)，AeMYB1R1屬于SHAQKYF類MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，研究表明，SHAQKYF類MYBs可以調(diào)控植物的防御反應(yīng)機(jī)制[17]，這也暗示了AeMYB1R1可能參與秋葵的抗脅迫機(jī)制。

在柳枝稷(PanicumvirgatumL.)中，PvMYB4在葉片、葉鞘、節(jié)間、花序和節(jié)間表達(dá)量較高，但在根部表達(dá)受限[18]。在茶樹(Camelliasinensis)中，CsMYB47和CsMYB17在葉和芽中高表達(dá)，CsMYB34則在老葉、莖和根部特異性表達(dá)[19]。Yang等[20]證明，在白果樹(GinkgobilobaL.)中，MYB41在未成熟和成熟果實(shí)中表現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)錄積累，MYB1在根和莖部高表達(dá)，而MYB5、MYB7、MYB21、MYB24、MYB25、MYB49、MYB52和MYB57則在所有組織中幾乎無表達(dá)。以上研究表明，MYBs具有顯著的組織表達(dá)特異性。在橡膠(Heveabrasiliensis)的愈傷組織萌發(fā)中，HbMYB1R1被鑒定為體細(xì)胞胚胎發(fā)育的關(guān)鍵標(biāo)記基因[21]。本研究中，AeMYB1R1在秋葵葉中表達(dá)量最高，其次是根部，而在莖部的表達(dá)水平最低，說明AeMYB1R1基因在秋葵中具有器官表達(dá)特異性，并可能在秋葵的發(fā)育過程中起到重要作用。

除了在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的功能，MYBs在植物響應(yīng)脅迫的作用逐漸被揭示。蘋果中的MdMYB308L通過與MdbHLH33的相互作用，增強(qiáng)其與MdCBF2和MdDFR啟動(dòng)子的結(jié)合，從而充當(dāng)蘋果耐寒性和花青素積累的正調(diào)節(jié)劑[22]。黃角牛(Xanthocerassorbifolium)中的XsMYB44通過觸發(fā)氣孔關(guān)閉以維持水位和調(diào)節(jié)ROS穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而抵御干旱和高溫的聯(lián)合脅迫[23]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AeMYB1R1特異性地應(yīng)答高溫、鹽、干旱和低溫脅迫；同時(shí)，與高溫和低溫脅迫相比，AeMYB1R1在鹽脅迫和干旱脅迫下的相對(duì)表達(dá)量更為顯著。據(jù)報(bào)道，玉米ZmMYB3R受干旱、鹽分和脫落酸誘導(dǎo)，其在擬南芥中的過表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱脅迫和鹽脅迫的耐受能力[24]。番茄LeMYB49可作為一種正調(diào)節(jié)劑，通過增強(qiáng)清除活性氧的能力，抑制細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞死亡，保護(hù)葉綠體，從而提高對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性[25]。芝麻中的SiMYB75受干旱脅迫、鹽脅迫、脫落酸和甘露醇強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在根部特異性表達(dá)，并通過脫落酸介導(dǎo)的途徑正向調(diào)節(jié)干旱、鹽分和滲透脅迫反應(yīng)[26]。以上研究表明，部分MYBs參與了脫落酸介導(dǎo)的活性氧清除途徑，從而響應(yīng)鹽堿和干旱環(huán)境帶來的滲透壓脅迫。因此，我們推測(cè)AeMYB1R1可能受脫落酸介導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)活性氧清除系統(tǒng)，從而參與秋葵響應(yīng)鹽和干旱脅迫的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究以‘北海道1號(hào)’秋葵為試驗(yàn)材料，擴(kuò)增并獲得了1個(gè)編碼AeMYB1R1轉(zhuǎn)錄因子的基因AeMYB1R1，并發(fā)現(xiàn)其在葉中特異性表達(dá)。通過對(duì)該基因在多種非生物脅迫中表達(dá)模式的分析，發(fā)現(xiàn)AeMYB1R1特異性地響應(yīng)高溫脅迫和低溫脅迫，尤其在鹽脅迫和干旱脅迫下，該基因的相對(duì)表達(dá)量顯著提高，因此推測(cè)AeMYB1R1是調(diào)控秋葵抗鹽和抗旱的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。本研究為了解AeMYB1R1基因在秋葵生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆境機(jī)制提供了一定的理論參考，以便為秋葵的育種和抗逆性增強(qiáng)工作奠定基礎(chǔ)。