蔣永祥 吳新華 盧奕

白內(nèi)障術(shù)后后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)的發(fā)生機(jī)制是術(shù)后由于炎性反應(yīng)和血-房水屏障破壞，在大量分泌的細(xì)胞外基質(zhì)及各種細(xì)胞因子的參與下，殘余晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cell,LEC)在后囊膜上增殖、遷移及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[1-2]。因此，抑制LEC增殖是預(yù)防PCO發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。白內(nèi)障LEC中的端粒酶活性和端粒長度明顯大于正常組,而晶狀體摘除術(shù)后PCO模型中，赤道部囊膜組織、后囊膜LEC中均可檢測到端粒酶活性[3-4]。抑制端粒酶活性可達(dá)到抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的目的。RNA干擾(RNA interference,RNAi)通過人為引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的小雙鏈RNA，誘導(dǎo)內(nèi)源性靶基因降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的，是一項快速、高效、便于操作的使靶基因失活技術(shù)[5]。本研究通過端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)RNAi技術(shù)抑制LEC TERT，達(dá)到抑制LEC增殖的目的，以期為進(jìn)一步抑制白內(nèi)障術(shù)后PCO提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人LEC株(SRA 01/04)購自美國ATCC公司。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cell,RPEC)由本實驗室制備。TERT小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)、陰性對照siRNA及轉(zhuǎn)染試劑盒為美國Ambion公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 TERT siRNA的設(shè)計和合成 根據(jù)基因庫中TERT mRNA序列(NM003219)，設(shè)計和合成針對TERT顯性失活突變體區(qū)的siRNA。序列如下,正義鏈:5′-CAAGGUGGAUGUGACGGGCTT-3′，反義鏈: 3′-TTGUUCCACCUACACUGCCCG-5′。經(jīng)基因庫檢索，與TERT以外的基因序列無同源性。

1.2.2 LEC和RPEC TERT mRNA表達(dá)的檢測 將LEC 和RPEC放入含15%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、80萬U/L青霉素及1 g/L鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長匯合后按1∶2傳代，將對數(shù)生長期的細(xì)胞以4×105細(xì)胞/孔的濃度接種于六孔板內(nèi)，采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-PCR)法，提取每處理孔細(xì)胞總RNA。TERT引物：5′-GCCAGAACGTTCCGCAGAGAAAA-3′，5′-AATCATCCACCAAACGCAGGAGC-3′。反應(yīng)條件為94 ℃ 20 s、48 ℃ 30 s 、72 ℃ 30 s，30個循環(huán)。設(shè)立空白陰性對照組，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外線照相并掃描分析。

1.2.3 TERT siRNA對LEC內(nèi)源性TERT表達(dá)的影響 取培養(yǎng)的LEC，以4×105細(xì)胞/孔的濃度接種于六孔板內(nèi)，加入不含抗生素的DMEM(含15%胎牛血清)2 mL進(jìn)行培養(yǎng)，以便轉(zhuǎn)染時細(xì)胞達(dá)到90%～95%匯合。按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明調(diào)整TERT siRNA至終濃度為50 nmol/L，加入細(xì)胞；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞,抽提細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄，實時PCR檢測TERT基因表達(dá)的變化。

1.2.4 TERT siRNA對轉(zhuǎn)染LEC和RPEC增殖抑制作用的觀察 取培養(yǎng)的LEC和RPEC，以4×105細(xì)胞/孔的濃度接種于六孔板內(nèi)，加入不含抗生素的DMEM(含15%胎牛血清)2 mL進(jìn)行培養(yǎng)；調(diào)整TERT siRNA至終濃度為50 nmol/L，加入細(xì)胞;48 h后，消化細(xì)胞1/3傳代；60 h，再次使用TERT siRNA(終濃度為50 nmol/L)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；96 h，細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)檢測細(xì)胞增殖能力的變化；按楊晉等[6]介紹的方法檢測LEC和RPEC的細(xì)胞活性，每組細(xì)胞做4組平行樣。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用成組設(shè)計t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

半定量RT-PCR檢測LEC和RPEC內(nèi)源性TERT mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示RPEC中檢測不到TERT的表達(dá)，LEC中可檢測到低水平的TERT表達(dá)(圖1)。

圖1. LEC和RPE中內(nèi)源性TERT mRNA的表達(dá)

TERT siRNA處理LEC 48 h后，實時PCR檢測TERT基因表達(dá)的變化：LEC對照組TERT mRNA相對表達(dá)水平為1.00±0.03，LEC siRNA組TERT mRNA相對表達(dá)水平為0.20±0.01，兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-38.40，P<0.05)。

TERT siRNA處理LEC、RPEC 96 h后，CCK-8檢測2種細(xì)胞的增殖抑制情況顯示：LEC對照組活性為0.79±0.02，LEC siRNA組為0.55±0.04，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.18，P<0.05)；RPEC對照組活性為1.16±0.01，RPEC siRNA組為1.13±0.04,兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.81，P>0.05)。

3 討論

染色體端粒DNA的長度是由端粒增長(端粒酶合成)和縮短(細(xì)胞分裂時DNA復(fù)制)的平衡來維持的，其中端粒酶活性對維持端粒長度及細(xì)胞長期生存有重要意義。端粒酶的激活使端粒長度不斷延長，細(xì)胞獲得無限增殖能力，可成為永生化細(xì)胞。因此，端粒酶的激活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或增殖活躍的組織細(xì)胞密切相關(guān)。端粒酶由端粒酶RNA成分、端粒酶相關(guān)蛋白1和TERT三部分組成。端粒酶RNA成分、端粒酶相關(guān)蛋白1在許多缺乏端粒酶活性的正常組織中表達(dá)，與端粒酶表達(dá)無相關(guān)性。TERT是端粒酶的催化亞單位，是決定端粒酶活性的限速決定因子，與端粒酶表達(dá)呈一致性[7]。TERT mRNA只在惡性腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞株以及某些有高度再生潛力的自我更新組織中表達(dá)。

在既往我們的實驗中，建立兔PCO模型，取赤道部囊膜組織、混濁后囊膜，檢測兩者LEC端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)兔晶狀體赤道部囊膜組織、后囊膜均可檢測到端粒酶活性，兔PCO模型LEC中端粒酶活性較赤道部囊膜LEC低[4]。

RNAi技術(shù)主要是通過siRNA來執(zhí)行其阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)的功能，siRNA在細(xì)胞內(nèi)與靶基因特異性結(jié)合并使之降解。目前合成siRNA分子有化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄等體外合成法以及以質(zhì)?；虿《绢愝d體介導(dǎo)的體內(nèi)表達(dá)法。

LEC中可檢測到低水平的TERT表達(dá)，本實驗通過體外合成TERT siRNA干擾TERT基因，抑制人LEC端粒酶活性。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染TERT siRNA的LEC，其TERT mRNA相對表達(dá)水平明顯下降，提示TERT siRNA抑制了其端粒酶活性。同時，細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，TERT siRNA處理96 h后的LEC，CCK-8檢測其增殖活性明顯抑制?？梢?，TERT siRNA在抑制端粒酶活性的同時也抑制了細(xì)胞增殖。

在正常體細(xì)胞中，除生殖細(xì)胞和造血干細(xì)胞等極少數(shù)細(xì)胞外，均檢測不到端粒酶活性。已有研究[8]證明，眼內(nèi)晶狀體纖維細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和睫狀體無色素細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)端粒酶表達(dá)。我們的實驗也證實RPEC中未檢測到TERT表達(dá)。轉(zhuǎn)染TERT siRNA 96 h后，RPEC的增殖活性也未受到影響。

因此，抑制LEC端粒酶活性，可有效抑制LEC的增殖，對眼內(nèi)其他組織細(xì)胞影響較小，這可能是抑制白內(nèi)障術(shù)后后囊膜混濁一個較有前途的治療方法。

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[4]呂志剛,黃文麗,蔣永祥,等.端粒酶活性在兔后囊膜混濁晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].中華眼科雜志,2008,44(10):902-905.

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[6]楊晉,盧奕,郭禮和,等.慢病毒介導(dǎo)的單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷體系抑制人晶狀體上皮細(xì)胞的研究[J].中華眼科雜志,2007,43(9):810-816.

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