劉 琪， 李同義， 于志勇

中心體蛋白(ninein-like protein, Nlp)是γ-微管蛋白復(fù)合物結(jié)合蛋白家族(GTBPs)中的一員，是有絲分裂過程中必不可少的成分[1]。Nlp的主要功能是促進(jìn)微管成核，從而促進(jìn)中心體成熟、紡錘體形成和染色體分離。近年來，諸多研究發(fā)現(xiàn)Nlp在乳腺癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等上皮腫瘤中過度表達(dá)，其有可能作為癌癥臨床診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。本文就目前國內(nèi)外Nlp的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 Nlp在細(xì)胞有絲分裂中的作用

Nlp為細(xì)胞主要微管組織的中心，在細(xì)胞周期中調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、粘附和活動性，在有絲分裂過程中促進(jìn)微管組成。在有絲分裂階段的開始，每一個中心體都有一對中心粒植入到無定形的中心粒外周物質(zhì)，經(jīng)過結(jié)構(gòu)和功能重組，促成中心體成熟[2]。重組過程的主要特征在于γ-微管蛋白的聚集，包括中心體復(fù)合物和微管蛋白成核性能的共同增長，此時(shí)主要的中心粒外周物質(zhì)組分會大量改變[3]。許多蛋白激酶和磷酸酶，包括polo-樣激酶1(plk1)，有絲分裂酶A(Aurora A)和相關(guān)性激酶2(Nek2)，蛋白磷酸酶4也與中心體成熟的調(diào)節(jié)有關(guān)[4]，但是這些促進(jìn)中心體成熟的酶底物尚未完全確定。在哺乳動物細(xì)胞中，Nlp以依賴細(xì)胞周期的方式表達(dá)且在G2/M轉(zhuǎn)化時(shí)達(dá)到高峰。Nigg等[5]研究表明Nlp在G2/M轉(zhuǎn)換時(shí)需要從成熟的中心體中移除，Nlp在G2/M轉(zhuǎn)換中的磷酸化作用能使其從中心體分離，這是中心體與有絲分裂紡錘體的形成的關(guān)鍵步驟。多數(shù)動物細(xì)胞和酵母菌的大部分微管蛋白從微管組織中心成核，尤其是中心體和紡錘體極體。這個過程主要取決于γ-微管蛋白的四級結(jié)構(gòu)的聚集，只有在微管組織中心聚集之后才能被激活[6]。但是這些復(fù)合體被召集到中心體的機(jī)制仍未發(fā)現(xiàn)。在大多數(shù)情況下，γ-微管蛋白復(fù)合體結(jié)合蛋白的行為應(yīng)該像γ-微管蛋白復(fù)合體接收器一樣并且有助于微管蛋白成核[7]。到目前為止，只有一小部分的γ-微管蛋白復(fù)合體結(jié)合蛋白被識別，即在較低等的生物或者脊椎動物，尤其是在釀酒酵母的Spc72 (spindle pole body component of 72 kDa)和Spc110 (spindle pole body component of 110 kDa)中[8]。Casenghi等[9]發(fā)現(xiàn)動力蛋白-動力蛋白激活蛋白復(fù)合體能夠?qū)lp植入中心體。通過Plk1的負(fù)調(diào)節(jié)、磷酸化促進(jìn)中心體Nlp的釋放，可防止中心體通過動力蛋白-動力蛋白激活蛋白動力復(fù)合體再提供Nlp。

2 Nlp與腫瘤形成的相關(guān)性

2.1 Nlp在腫瘤組織中表達(dá) 有絲分裂過程的終止會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)化[10]。有絲分裂成分的異常，比如plk1、Aurora-A、survivin、cycling B1和Nek2都與腫瘤生成和病情進(jìn)展密切相關(guān)。上述蛋白質(zhì)在各種人類腫瘤中常表現(xiàn)出基因擴(kuò)增或者無控制表達(dá)。有絲分裂的缺陷與中心體的畸形密切相關(guān)，包括結(jié)構(gòu)改變，如中心體數(shù)量增加、體積增大以及中心粒外周物質(zhì)的增加；多余的中心粒以及功能的缺陷，比如微管聚集性增強(qiáng)[11]。中心體異?？赡馨l(fā)生在腫瘤生成的早期階段這一觀點(diǎn)已被廣泛接受，諸多研究認(rèn)為中心體異常應(yīng)該是基因不穩(wěn)定的主要原因[12-15]，其會導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[16-18]。然而，中心體異常導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和惡性過程的潛在機(jī)制還需要進(jìn)一步確定。Shao等[10]通過熒光檢測和印跡技術(shù)分析顯示轉(zhuǎn)基因動物中Nlp的表達(dá)。外源性Nlp的表達(dá)在大多數(shù)組織中都能檢測到，比如肺、腎臟、乳腺、胸腺、睪丸及皮膚等。對轉(zhuǎn)基因小鼠與正常小鼠進(jìn)行射線處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nlp轉(zhuǎn)基因小鼠接受射線處理后，在20周時(shí)發(fā)現(xiàn)第1例淋巴瘤，在第28周時(shí)有8只小鼠發(fā)生淋巴瘤，但是正常組第24周時(shí)才發(fā)現(xiàn)第1例淋巴瘤，在第28周2只鼠發(fā)生淋巴瘤。轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠接受射線處理后發(fā)生淋巴瘤情況的比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)。然而，在第32周，20只轉(zhuǎn)基因小鼠中的12只和20只正常組中的8只發(fā)現(xiàn)患有淋巴瘤。此外，Nlp轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)生的淋巴瘤惡性程度更高并且具有侵襲性。接受射線處理的正常小鼠組，淋巴瘤只是在胸腺，較小地侵襲周圍器官，而在轉(zhuǎn)基因小鼠中，大多數(shù)淋巴瘤不僅僅在胸腺，還非常易于侵襲心臟和肺組織。因此，轉(zhuǎn)基因小鼠更易受射線誘導(dǎo)發(fā)生腫瘤。從Nlp轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠中分離出來的MEFs(mouse embryonic fibroblasts)接受射線處理，進(jìn)而行細(xì)胞凋亡分析，22%來源于正常小鼠的MEFs發(fā)生細(xì)胞凋亡，7%來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的MEFs出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。UV處理后，12%來源于正常組織的MEFs發(fā)生細(xì)胞凋亡，5%的轉(zhuǎn)基因小鼠MEFs發(fā)生細(xì)胞凋亡。這說明Nlp的過度表達(dá)會明顯減弱DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.2 Nlp誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化 正如前述，腫瘤組織Nlp的基因擴(kuò)增，Nlp mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)增加。研究中Nlp過度表達(dá)時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)大的轉(zhuǎn)化能力，Shao等[10]亦進(jìn)行了相關(guān)的列研究，其將pEGFP-Nlp表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到NIH3T3嚙齒類動物的纖維母細(xì)胞以其獲得性高表達(dá)Nlp的細(xì)胞中，使用合并的克隆體(3T3-Pool)和獨(dú)立的克隆體(3T3-53, 3T3-58, 3T3-78)對腫瘤發(fā)生進(jìn)行分析，這些同基因細(xì)胞系與親代NIH33T3細(xì)胞或者轉(zhuǎn)染空pEGFP載體的細(xì)胞相比，表現(xiàn)出快速增長的特性。混合的克隆體和所有表達(dá)Nlp的3個同基因的細(xì)胞系當(dāng)在瓊脂上生長時(shí)形成大量體積大的克隆體。然而，其母代NIH3T3和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞僅僅形成極少的微小的克隆體，這表明Nlp給予細(xì)胞非依賴生長的特性。隨后，其將表達(dá)Nlp的NIH3T3經(jīng)皮下注射到60只裸鼠中，58只形成腫瘤，另外10只注射對照細(xì)胞的小鼠都沒有出現(xiàn)腫瘤。HE染色表明腫瘤經(jīng)過分化在組織上會變成肉瘤，免疫組化表明腫瘤的Nlp染色呈強(qiáng)陽性。動物死后將異種移植物移除，將基因組的DNA從腫瘤中分離出來，并用PCR檢測小鼠Nlp和人類Nlp基因。結(jié)果正如陽性對照組，小鼠Nlp基因在MEFs中檢測到，人類Nlp在HeLa細(xì)胞系中檢測到。小鼠Nlp和人類Nlp都在異種移植物中發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，異種移植物來源于Nlp表達(dá)的NIH3T3小鼠纖維細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)表明，Nlp是具有致癌性并且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

3 過度表達(dá)Nlp的人體腫瘤

3.1 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC) Yu等[19]首次分析了Nlp蛋白在HNSCC腫瘤組織中的表達(dá)，用免疫組化的方法檢測了76例臨床腫瘤樣本和68例正常鄰近組織樣本。結(jié)果在76例HNSCC樣本中有50例(65.8%)發(fā)現(xiàn)Nlp蛋白呈陽性或者強(qiáng)陽性細(xì)胞質(zhì)染色，26例(34.2%)弱或者陰性染色(0～1分)；在正常周圍組織中僅3例表現(xiàn)為Nlp蛋白染色陽性。與免疫組化分析一致，通過印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，20例腫瘤樣本中有14例與其對應(yīng)的正常組織相比表現(xiàn)出Nlp過度表達(dá)。實(shí)時(shí)RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性HNSCC樣本與其正常周圍組織對比中有較高的Nlp mRNA表達(dá)。在所有樣本中，比較腫瘤與非腫瘤組織中Nlp mRNA的倍數(shù)變化(0.175～15.7倍)，20例中12例樣本評估Nlp mRNA水平倍數(shù)大于1。此外，Nlp蛋白表達(dá)與腫瘤分級有明顯地相關(guān)性，雖然在晚期HNSCC或者有淋巴轉(zhuǎn)移的HNSCC Nlp表達(dá)較高，但是，Nlp蛋白表達(dá)與腫瘤分期(P=0.087)或淋巴結(jié)分級(P=0.078)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 卵巢癌 Qu等[20]將pEGFP-C3-Nlp或者空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3之后分析細(xì)胞增生和凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nlp在10個正常卵巢組織中1個陽性(10.0%)，34個良性腫瘤組織中5個陽性(14.7%)，26個交界性腫瘤中9個陽性(34.6%)，131個卵巢癌中73個陽性(55.7%)。免疫反應(yīng)強(qiáng)度與腫瘤分級明顯相關(guān)，而與FIGO(國際婦產(chǎn)科協(xié)會)分期和組織分型無關(guān)。Kaplan-Meier曲線表明Nlp過度表達(dá)與總的下降的生存率呈邊界性相關(guān)。在SKOV3細(xì)胞系，Nlp過度表達(dá)與抑制紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)?？傊?，Nlp在卵巢腫瘤組織中過度表達(dá)，Nlp與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。

3.3 宮頸癌 馬瑩等[21]采用免疫組化法和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測并比較28例宮頸癌組織及18例正常宮頸組織中Nlp的表達(dá)情況，并分析Nlp表達(dá)與宮頸癌臨床分期及分化程度的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，42.9%(12/28)的宮頸癌細(xì)胞核旁和(或)胞漿部位Nlp呈陽性表達(dá),正常宮頸組織均不表達(dá)Nlp，宮頸癌組織中Nlp的陽性表達(dá)在不同臨床期別和不同分化程度組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示Nlp在宮頸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織。Nlp表達(dá)陽性和表達(dá)陰性者中位生存時(shí)間分別為34個月和38個月。說明宮頸癌組織中Nlp在蛋白水平、mRNA水平都存在高表達(dá)者的預(yù)后相對差。

3.4 乳腺癌 Nlp與乳腺癌的關(guān)系主要集中在兩個方向。(1)BRCA1與Nlp在癌細(xì)胞有絲分裂過程中的相互作用：超過70%的遺傳性乳腺癌病例表達(dá)BRCA1，其為乳腺癌易感基因，與細(xì)胞周期的控制相關(guān)。目前已證實(shí)Nlp是一種BRCA1相互作用蛋白，并且其C端是在Nlp與BRCA1的相互作用中所需要的，這表明Nlp與BRCA1之間的相互作用可能與BRCA1在控制有絲分裂過程中的作用相互橋接。Jin等[22]的研究顯示，BRCA1對Nlp在中心體定位很重要。通過siRNA途徑或者敲除BRCA1與Nlp連接的區(qū)域，Nlp就不能在中心體定位。然而，BRCA1仍能夠通過E3的泛素化連接酶活性參與有絲分裂機(jī)制。BRCA1與紡錘體極性蛋白形成復(fù)合體，因而能確保TPX2(targeting protein for Xklp2)在紡錘體極端的正常濃度以及紡錘體極端正常的組裝，BRCA1的此功能是獨(dú)立于中心體之外的。(2)Nlp過度表達(dá)與乳腺癌化療耐藥：Zhao等[23]將Nlp表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到乳腺癌MCF-7細(xì)胞形成穩(wěn)定克隆。Nlp表達(dá)后用MTT和FCM法檢測，分析轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞的生存率，細(xì)胞周期的分配和凋亡。用免疫熒光法探測中心體蛋白和凋亡相關(guān)蛋白。隨后，檢測給予紫杉醇治療的55例乳腺癌標(biāo)本的Nlp表達(dá)情況。結(jié)果表明，過度表達(dá)Nlp的MCF-7細(xì)胞有更高的生存率。Nlp過度表達(dá)會減弱紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這與Bcl-2的升高一致。Nlp的大量表達(dá)會降低微管聚集以及紫杉醇導(dǎo)致β微管蛋白的結(jié)構(gòu)或動力的改變。高表達(dá)Nlp的乳腺癌患者可能會抵抗紫杉醇的治療作用，Nlp陰性患者的應(yīng)答率為62.5%，Nlp(+)和Nlp(++)分別為58.3%和15.8%(P=0.015)。Nlp表達(dá)與plk1和PCNA正相關(guān)。

3.5 肺癌 Shao等[10]通過RT-PCR分析技術(shù)測定肺癌組織和正常周圍組織中(各30例)的Nlp mRNA水平，其中18例肺癌組織中的Nlp mRNA水平高于正常組織2倍。此外，基因的PCR印跡技術(shù)分析也表明Nlp基因在人類肺癌組織中擴(kuò)增。為了進(jìn)一步證實(shí)研究結(jié)論，其用FISH來測定肺癌原發(fā)灶的拷貝數(shù)，Nlp的擴(kuò)增以一持續(xù)增加的數(shù)量在基因位點(diǎn)的雜交到Nlp BAC探針，共檢測肺癌組織和周圍正常組織各15例，結(jié)果為6例腫瘤組織有Nlp擴(kuò)增，但正常組織中均無擴(kuò)增。

4 展望

綜上所述，Nlp 作為新近發(fā)現(xiàn)的中心體相關(guān)蛋白，與多種人體腫瘤(如乳腺癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等)的發(fā)生相關(guān)。Nlp與BRCA1的相互作用對于Nlp中心體定位的維持和蛋白穩(wěn)定性非常重要，并且參與有絲分裂過程。Nlp過度表達(dá)對紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抵抗。這些發(fā)現(xiàn)為我們的腫瘤學(xué)基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用提供了新視角，Nlp可能成為腫瘤早期診斷和藥物治療的重要分子靶點(diǎn)；也為深入了解惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)理，尋找早期診斷標(biāo)志，確定特異性腫瘤藥物治療靶點(diǎn)和制定有效的腫瘤治療方案提供新思路和理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，細(xì)胞周期的調(diào)控是一系列復(fù)雜的過程，也不僅限于現(xiàn)在所發(fā)現(xiàn)的分子學(xué)機(jī)制，相信隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，會有更多的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的分子生物學(xué)功能和相關(guān)機(jī)制被發(fā)現(xiàn)。

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