李 冉， 劉 江， 崔建忠， 王凱杰， 徐愛軍， 王海濤， 高俊玲

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)可導致顱內(nèi)發(fā)生一系列并發(fā)癥，是患者病殘和死亡的主要原因［1］。研究證實SAH后血管壁內(nèi)皮細胞凋亡現(xiàn)象在SAH病理進程中起關鍵作用［2］，最終可導致腦損傷后期的神經(jīng)功能缺陷［3］。細胞凋亡多通過半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteine asparti cacid-specific protease，caspase)介導的信號途徑完成，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)級聯(lián)途徑是SAH后重要的信號轉(zhuǎn)導通路，已有研究證實腦缺血性損傷中ERK在炎性反應等方面發(fā)揮了重要作用［4］，應用ERK抑制劑U0126預處理可減少腦創(chuàng)傷模型60%的腦部損傷面積［5］。類似機制是否存在于SAH模型小鼠神經(jīng)元凋亡過程仍不清楚。近年的研究多集中于SAH后遲發(fā)性腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)及并發(fā)癥的防治，對SAH早期腦損傷分子機制研究甚少。本研究對ERK、caspase-8在小鼠SAH損傷中的作用進行研究，旨在探討ERK通路在SAH早期腦損傷中的分子機制。

1 材料和方法

1．1 材料 β-actin鼠單克隆抗體(Sigma)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG(Sigma)，預染蛋白 Marker(灝洋生物)，phosphorated-ERK多克隆抗體(Cell signaling)，TUNEL試劑盒(Roche)，U0126(Promega)，caspase-8 兔抗鼠多克隆抗體(Santa cruz biotechnology，Inc)。健康雄性ICR小鼠由北京維通利華動物中心［SCXK(京)2002-2003］90只，體質(zhì)量28～32g，隨機分為假手術對照組(Sham組)18只;模型組(SAH組)36只;U0126干預組(SAH+U0126組)36只，各組分為SAH 12、24、48h 3 個亞組。

1．2 方法

1．2．1 動物模型的制備 參照文獻［6］的方法并略作改良，麻醉消毒后，于手術顯微鏡下自小鼠右側頸外動脈(ECA)經(jīng)頸內(nèi)動脈(ICA)導入5-0單纖維尼龍線，至大腦前動脈(ACA)與大腦中動脈(MCA)分叉處，刺破動脈壁，總進入長度約為(10±0．5)mm。假手術對照組將尼龍線僅送至ACA與MCA分叉處，稍感阻力即停止繼續(xù)插入，并迅速退出尼龍線。結扎頸外動脈的斷端，縫合皮膚，單籠飼養(yǎng)。將UO126溶解于DMSO中，于出血前30min 經(jīng)尾靜脈注射(0．05mg/kg，0．1mg/kg)，出血前30min、24h、48h 各給藥一次。

1．2．2 MCA形態(tài)學觀察 常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察MCA形態(tài)學改變。

1．2．3 TUNEL法檢測大腦中動脈內(nèi)皮細胞凋亡 小鼠麻醉開胸，70mmHg壓力下經(jīng)左心室灌注等滲鹽水至流出液體清亮，4%多聚甲醛PBS(pH 7．2 ～7．4)緩沖液 100ml灌注，斷頭取腦，取大腦中動脈至大腦前動脈分叉處前后3mm范圍的腦組織冠狀切開，入4%多聚甲醛室溫后固定2h，入4℃20%蔗糖磷酸鹽緩沖液，應用恒冷箱切片機連續(xù)冠狀切片，片厚20μm。按原位細胞凋亡檢測試劑盒提供的實驗步驟進行，DAB顯色。采用CMIAS真彩色醫(yī)學圖像自動分析系統(tǒng)進行TUNEL陽性細胞計數(shù)，隨機記數(shù)小鼠MCA陽性細胞數(shù)。

1．2．4 免疫印跡法檢測大腦動脈p-ERK1/2、caspase-8蛋白表達 10%水合氯醛(0．30ml/kg)腹腔注射麻醉動物后斷頭取腦，于手術顯微鏡下低溫快速分離右側大腦動脈(ICA、ACA、MCA)，置于4℃預冷的全細胞裂解液0．6ml冰水浴中勻漿，12000r/min 4℃離心5min，取上清液。以考馬斯亮藍G250結合法蛋白定量，－80℃保存?zhèn)溆?。?5μg蛋白樣本加入2×SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸5min，6000r/min離心3min，取上清液上樣，用12%(w/v)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉2h，分別加入p-ERK1/2、caspase-8一抗4℃過夜，加辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗和預染蛋白Marker，室溫下震蕩孵育1h，濾膜漂洗后加入 DAB顯色。將特異性蛋白條帶進行掃描后，在同一條件下應用CMIAS真彩醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定目標條帶整合光密度值(IDV)，計算出各組樣品目標條帶與內(nèi)參(β-actin)的IDV比值。

1．2．5 統(tǒng)計學處理 實驗中所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示。應用SPSS 12．0軟件，對其進行單因素方差分析，相關因素進行相關分析，以P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 顱底解剖學檢查 假手術組無出血。SAH造模后各時間點均有明顯出血，累及整個Willis環(huán)，尤以右側為著;SAH 48h出血部分吸收，可見陳舊性血塊附著于Willis環(huán)周圍，符合SAH研究要求。

2．2 MCA形態(tài)學改變 假手術組MCA管腔光滑，內(nèi)皮細胞排列平整。與假手術組相比，SAH 48h MCA呈現(xiàn)強力收縮，HE染色下內(nèi)彈性膜呈波紋狀皺縮，內(nèi)皮細胞腫脹，排列不整齊，被鄰近波紋狀的內(nèi)彈性膜扭曲而突向腔內(nèi)，血管壁顯著增厚，管腔明顯狹窄，平滑肌細胞收縮，個別內(nèi)皮細胞脫落。U0126可緩解CVS，改善內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞壞死。

2．3 TUNEL檢測MCA細胞凋亡結果 假手術組偶見TUNEL陽性細胞(1．305±0．12)。模型組12h TUNEL陽性細胞開始增加，48h達高峰，細胞胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)凝集，核深染，呈深棕色顆粒狀，陽性細胞在MCA所有層面均有表達，尤以內(nèi)皮細胞及中膜平滑肌細胞為著，SAH12、24、48h差異均有統(tǒng)計學意義(11．253 ± 0．121，33．663 ± 0．118，58．174 ±0．115;均P＜0．05)。U0126 干預組各時相點TUNEL陽性細胞均不同程度減少，24、48h差異有統(tǒng)計學意義(29．312 ±0．119，41．327 ±0．117;均P＜0．05)。

2．4 免疫印跡法檢測結果

2．4．1 p-ERK1/2蛋白免疫印跡法檢測結果假手術組少量p-ERK1/2表達;模型組p-ERK1/2在出血后12h明顯增加，24h達高峰，48h降低，12、24、48h差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。U0126干預組各時相點p-ERK1/2表達均有不同程度降低;24、48h差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

2．4．2 caspase-8蛋白免疫印跡法檢測結果假手術組caspase-8少量陽性表達，模型組12h蛋白量明顯增加，24h達高峰，48h降低，但仍高于基礎水平，12、24、48h 差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。U0126干預組各時相點caspase-8表達均有不同程度降低;12、24、48h差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

3 討論

本實驗顯示模型組小鼠痙攣大腦動脈TUNEL染色呈陽性，在MCA所有層面均有表達，說明凋亡在SAH損傷中發(fā)揮了重要作用。研究證實SAH后血管壁細胞凋亡和在此基礎上出現(xiàn)的血管壁增生及構建相關［7］，因此，減少或阻斷細胞凋亡通路是保護腦組織的一個重要的治療方向。

神經(jīng)元凋亡與出血后腦組織復雜的信號轉(zhuǎn)導通路激活具有相關性，其中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族中的 ERK通路發(fā)揮了重要作用。有研究表明利用多巴胺能受體轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)ERK激活主要發(fā)生在直接轉(zhuǎn)導通路中［8］。本實驗中SAH24h p-ERK1/2表達達高峰，隨時間延長TUNEL陽性細胞增加，提示本次實驗條件下，ERK的激活可能導致了細胞凋亡，出血后凋亡的發(fā)生與 CVS密切相關［9］，p-ERK1/2在CVS進程中起了重要的作用［10］。ERK1/2是一種重要信號轉(zhuǎn)導蛋白，當有害刺激信號作用于細胞表面受體時，可激活GTP結合蛋白RAS，繼而激活Raf-1，Raf-1可磷酸化MEK，p-MEK進一步磷酸化ERK1/2，之后p-ERK1/2使細胞核內(nèi)的Elk-1磷酸化，此瀑布式磷酸化活化過程將激活與細胞損傷有關的即刻反應基因和晚反應基因的表達，調(diào)節(jié)細胞的生長和分化。Aoki等［11］利用兩次注血 SAH模型觀察到，注血可造成基底動脈CVS，MEK抑制劑PD98059可明顯降低ERK1/2表達水平，并且可顯著逆轉(zhuǎn)CVS，使痙攣的血管內(nèi)徑增加。本實驗中顱底解剖可見大量出血，鏡下觀察顯示出血可導致SAH小鼠MCA管腔狹窄、管壁增厚，受傷小鼠患側對側肢體癱瘓，出現(xiàn)左旋追尾現(xiàn)象，說明SAH后強烈的血管痙攣可能造成行為學改變。ERK表達高峰早于TUNEL陽性標記的高峰，說明ERK發(fā)生時間早于凋亡;抑制劑組p-ERK1/2的表達水平明顯低于模型組，提示U0126可通過調(diào)節(jié)p-ERK1/2的活化水平而影響凋亡進程，可能對出血性腦損傷具有保護作用。

為明確p-ERK1/2是否誘導了caspase凋亡通路，本實驗應用ERK抑制劑，并檢測了下游caspase-8表達。caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，由上游啟動型caspase激活下游效應caspase組成瀑布式級聯(lián)反應。啟動型caspase包括caspase-2、8、9和10，通過自身活化啟動凋亡程序并調(diào)節(jié)效應型caspase-3;效應型caspase包括caspase-3、6和7，能分解細胞蛋白引起細胞凋亡。caspase蛋白酶主要以無活性酶原形式存在于細胞質(zhì)中，受到凋亡刺激后被激活，直接參與凋亡早期啟動和凋亡信號的傳遞。本實驗觀察到出血后caspase-8免疫反應陽性神經(jīng)元不斷增加，至SAH 48h與凋亡細胞數(shù)目同時達高峰，進一步說明caspase-8活化可能是SAH后細胞凋亡的關鍵環(huán)節(jié)之一。研究證實caspase-8是關鍵的啟動型caspase，其可通過特殊的細胞信號途徑導致caspase-3激活，將凋亡信號傳至caspase-3，caspase-3活化物能裂解DNA修復酶，使細胞不可逆地發(fā)生凋亡改變，包括核濃縮和 DNA斷裂，最終導致細胞凋亡［12］。

本實驗中ERK抑制劑U0126在抑制p-ERK1/2的同時部分阻抑了caspase-8的活化，提示ERK可能位于上游并可活化caspase-8。應用U0126可在腦損傷的啟動階段通過阻抑p-ERK1/2、caspase-8等一系列級聯(lián)因子的作用，減少凋亡細胞的增加，在損傷的上游階段阻斷病情發(fā)展，其對出血性神經(jīng)損傷可能具有一定的靶向作用。

［1］Cengiz SL，Erdi MF，Avunduk MC，et al．The role of intravenous immunoglobulin in the treatment of cerebral vasospasm induced by subarachnoid haemorrhage:A experimental study［J］．Brain Inj，2011，25(10):965－971．

［2］Ayer RE，Ahang JH．Oxidative stress in subarachnoid haemorrhage:significance in acute brain injury and vasospasm［J］．Acta Neurochir Suppl，2008，104(1):33 －34．

［3］Cahill J，Calvert JW，Zheng JH．Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2006，26(11):1341－1353．

［4］Lu K，Cho CL，Liang CL，et al．Inhibition of the MEK/ERK pathway reduces microglial activation and interleukin-1-beta expression in spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats［J］．J Thorac Cardiovasc Surg，2007，133(4):934 －941．

［5］Clausen F，Lundqvist H，Ekmark S，et al．Oxygen free radical-dependent activation of extracellular signal-regulated kinase mediates apoptosis-like cell death after traumatic brain injury［J］．J Neurotrauma，2004，21(9):1168 －1182．

［6］Gao J，Wang H，Sheng H，et al．A novel apoE-derived peptide therapeutic reduces vasospasm and improves outcome in a murine model of subarachnoid hemorrhage［J］．Neurocrit Care，2006，4(1):25 －31．

［7］Zhou C，Yamaguchi M，Colohan AR，et al．Role of p53 and apoptosis in cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2005，25(5):572 －582．

［8］Santini E，Alcacer C，Cacciatore S，et al．L-DOPA activates ERK signaling and phosphorylates histone H3 in the striatonigral medium spiny neurons of hemiparkinsonian mice［J］．J Neurochem，2009，108(3):621－633．

［9］Kawanabe Y，Masaki T，Hashimoto N．Involvement of epidermal growth factor receptor-protein tyrosine kinase transactivation in endothelin-1-induced vascular contraction［J］．Neurosurgery，2004，100(6):1066－1071．

［10］Kusaka G，Kimura H，Kusaka I，et al．Contribution of Src tyrosine kinase to cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage［J］．Neurosurgery，2003，99(2):383 －390．

［11］Aoki K，Zubkov AY，Tibbs RE，et al．Role of MAPK in chronic cerebral vasospasm［J］．Life Sci，2002，70(16):1901 －1908．

［12］Ferrer I，Planas AM．Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia:life and death struggle in the penumbra［J］．J Neuropathol Exp Neurol，2003，62(4):329 －339．