蔡兆根 于東紅＊ 田 甜 吳海波 趙 艷 馮振中

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床病理科，蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽233003；2南京金陵司法鑒定所，江蘇210000；3安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床病理科，安徽230001）

國內(nèi)外有關(guān)Hp感染與胃癌關(guān)系的研究較多，并已成定論，而Hp-L型感染與胃癌關(guān)系的研究較少，Hp-L型與胃癌的淋巴道轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系罕見報(bào)道［1］。腫瘤淋巴管新生在實(shí)體瘤（包括胃癌）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。D2-40和LYVE-1抗體是新發(fā)現(xiàn)的比較特異的淋巴管標(biāo)志物，因能特異地與淋巴管內(nèi)皮反應(yīng)而被廣泛地用于標(biāo)記實(shí)體腫瘤組織中的淋巴管內(nèi)皮。微淋巴管密度（lymphatic microvessel density LVD）是反映腫瘤淋巴管生成的有效指標(biāo)。因此本研究應(yīng)用免疫組化及革蘭氏染色方法檢測幽門螺桿菌L型感染的情況、LVD值及VEGFR-3蛋白的表達(dá)，旨在探討胃癌組織中LVD、VEGFR-3蛋白表達(dá)和Hp-L型感染的關(guān)系。

材料和方法

1.標(biāo) 本

收集2010年7月至2011年6月間，蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的80例胃癌手術(shù)切除的石蠟標(biāo)本及相關(guān)臨床病例資料，從中隨機(jī)取切緣組織25例（作為正常對(duì)照組）。所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色切片組織學(xué)復(fù)查確認(rèn)。患者術(shù)前未進(jìn)行任何放化療、生物學(xué)治療及抗生素治療。男58例，女22例；年齡36-73歲，中位年齡為51歲。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者63例，無轉(zhuǎn)移者17例。

2.試 劑和方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，厚4μm，分別行常規(guī) HE染色、革蘭染色和免疫組化染色SP法。用已知陽性的組織切片作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，組織切片革蘭染色按常規(guī)染色進(jìn)行。濃縮型鼠抗人D2-40單克隆抗體（編號(hào)ZM-0465）和兔抗人VEGFR-3多克隆抗體（編號(hào)ZA-0267），購自北京中杉金橋公司；兔抗人LYVE-1多克隆抗體（編號(hào) BS-1311R），購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗人Hp-L型抗體由蚌埠醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室制備。

3.結(jié) 果判斷

3.1 幽門螺桿菌L型的檢測及結(jié)果判定

革蘭染色陰性呈紅色，陽性呈紫色，Hp-L型大多數(shù)呈革蘭染色陰性，少數(shù)Hp-L型革蘭染色陽性。Hp-L型形態(tài)多樣，大小不等，有巨形體、圓球體、短桿狀、長絲體等。在油鏡（10×100）下觀察并計(jì)數(shù)；每例隨機(jī)觀察8-10個(gè)不同視野，取平均數(shù)，L型菌數(shù)≥20個(gè)定為陽性，＜20個(gè)或未查見L型則為陰性。Hp-L型抗體免疫組化的陽性標(biāo)準(zhǔn)為：胃癌細(xì)胞、正常胃黏膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)巨噬細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜著棕黃色細(xì)顆粒為陽性。革蘭染色和免疫組化兩者同時(shí)陽性定為Hp-L型感染陽性。

3.2 免疫組化染色結(jié)果判定和淋巴管密度計(jì)算（LVD）

VEGFR-3在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色為棕黃色。D2-40、LYVE-1表達(dá)陽性均為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞著棕黃色或者棕褐色。本實(shí)驗(yàn)以D2-40、LYVE-1標(biāo)記同時(shí)陽性的淋巴管代表真正陽性的淋巴管并以此標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算LVD值；計(jì)數(shù)淋巴管時(shí)先于低倍視野下確定3個(gè)淋巴管密集區(qū)域（熱點(diǎn)），然后在40×10倍放大視野下記數(shù)，取3個(gè)區(qū)域高倍視野下淋巴管平均數(shù)作為腫瘤新生淋巴管密度值。

4.統(tǒng) 計(jì)學(xué)分析

微淋巴管密度以（ˉx±s）表示，使用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 15.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)性分析。以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.H p-L型的分布特點(diǎn)及檢測結(jié)果

觀察革蘭染色切片發(fā)現(xiàn)，Hp-L型大部分是革蘭染色陰性，多數(shù)為圓球形，可在癌巢、癌間質(zhì)或黏膜層聚集成堆，也可散在分布于其中，Hp-L型主要存在于胃癌癌巢和癌旁，癌巢的壞死處幾乎無Hp－L型，正常組織內(nèi)較少見。L型陽性的組織切片上均見到L型黏附于癌細(xì)胞及黏膜細(xì)胞表面的現(xiàn)象（圖1）。80例胃癌中有54例革蘭染色細(xì)菌陽性，陽性率為67.5%；免疫組化Hp-L型抗原表達(dá)陽性52例（見圖2），陽性率為65%，與革蘭染色L型檢出陽性率具有一致性（P＞0.05），兩組同時(shí)陽性的病例有50例，陽性率為62.5%，明顯高于對(duì)照組的24% （P＜0.01）。

2.胃 癌組織中 D2-40、LYVE-1標(biāo)記的微淋巴管形態(tài)特點(diǎn)和LVD值

D2-40、LYVE-1標(biāo)記陽性的微淋巴管管壁薄無肌層，形態(tài)欠規(guī)則，腔內(nèi)無紅細(xì)胞。在胃癌癌周組織中微淋巴管數(shù)目較多且多為開放的管腔；而在胃癌組織中心區(qū)微淋巴管數(shù)量較少且多為細(xì)小腔隙或條形閉鎖狀；對(duì)照組微淋巴管分布稀疏且主要位于粘膜下層和外膜層（圖3、4）。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示新生淋巴管主要位于癌周區(qū)，癌中心區(qū)相對(duì)較少，因此以癌周區(qū)的淋巴管數(shù)為主計(jì)算微淋巴管密度，結(jié)果顯示，80例癌周組織中D2-40標(biāo)記陽性的微淋巴管LVD值為27.34±4.61，LYVE-1標(biāo)記陽性的微淋巴管LVD值為26.75±6.34，兩者同時(shí)陽性的微淋巴管LVD值為25.48±5.87，兩者陽性率具有一致性（P＞0.05）；與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01表1）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組LVD值為28.43±4.36，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的21.34±3.25（P＜0.01）。

表1 胃癌癌周組織中D2-40、LYVE-1標(biāo)記陽性微淋巴管的LVD值Table 1 The lymphatic microvessel desenity marked by D2-40、LYVE-1in peripheral gastric carcinoma

3.V EGFR-3蛋白的表達(dá)及與LVD值和Hp－L型之間的相互關(guān)系

VEGFR-3主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)中，在間質(zhì)纖維細(xì)胞及脈管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)中亦有表達(dá)（圖5）。胃癌組織中VEGFR-3的陽性表達(dá)率44%（35／80），高于對(duì)照組的4%（1／25），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Hp-L型陽性組 VEGFR-3表達(dá)陽性率高于Hp-L型陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；VEGFR-3蛋白陽性組的LVD值為28.75±3.56，高于陰性組的21.45±5.16，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩者之間的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.532，P＜0.01）。Hp-L型陽性與 VEGFR－3蛋白表達(dá)和LVD呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.300，P＜0.05；r＝0.804，P＜0.01，表2）。

表2 胃癌組織中LVD值、VEGFR-3蛋白與Hp-L型之間的關(guān)系Table 2 Relationship between the expression of VEGF-C protein and the lymphatic microvessel density and helicobacter pylori L-form infection in gastric carcinoma

討 論

淋巴管形成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。以往對(duì)腫瘤淋巴管生成的研究因缺乏特異的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物而相對(duì)滯后于腫瘤新生血管的研究。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的一種分子質(zhì)量為40kDa、能特異性標(biāo)記腫瘤組織中淋巴管內(nèi)皮的單克隆抗體［2］。已有研究證明，D2-40在前列腺癌、腎癌和胃癌［3］等多種腫瘤的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上都有陽性表達(dá)。本研究結(jié)果顯示由D2-40標(biāo)記的微淋巴管具有一定的分布特點(diǎn)，在癌周組織中微淋巴管豐富且管腔較大，在癌中心區(qū)僅能見到少量的裂隙狀或條索狀微淋巴管結(jié)構(gòu)，這與 U Coskun等［4］的結(jié)論基本一致。LYVE-1是較特異的淋巴管標(biāo)記物之一，在腫瘤研究中經(jīng)常作為重要標(biāo)志蛋白來區(qū)分淋巴管和血管［5］。P Gao等［6］通過對(duì)63例胃癌研究發(fā)現(xiàn)LYVE-1在正常組織和癌組織的毛細(xì)淋巴管都呈陽性表達(dá)，而不表達(dá)于毛細(xì)血管及腫瘤細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)LYVE-1標(biāo)記的LVD值與胃癌組織的大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果與上述一致，并發(fā)現(xiàn)LYVE-1的表達(dá)與D2-40相類似。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)LYVE-1染色切片中部分腫瘤細(xì)胞也有少量非特異性染色，并且主要在分化差的癌組織內(nèi)觀察到此種現(xiàn)象，其原因可能是LYVE-1為多克隆抗體，存在交叉反應(yīng)所致，或是由于腫瘤自身具有形成淋巴管的趨勢，具體原因還有待研究，但是其總體染色結(jié)果未受到明顯影響。因此兩種標(biāo)記物聯(lián)合使用更能客觀的反應(yīng)胃癌組織中的淋巴管新生情況，從而得到比較可靠的LVD值。

VEGFR-3作為 VEGF-C、-D的受體，除表達(dá)于脈管組織外，許多腫瘤細(xì)胞本身也有VEGFR-3的表達(dá)，并通過自分泌的作用機(jī)制在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用［7］。已有證據(jù)表明，VEGFR-3可通過與其配體VEGF-C的結(jié)合，促進(jìn)實(shí)體瘤內(nèi)淋巴管的新生，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGFR-3在胃癌中的陽性表達(dá)率為44%，而對(duì)照組中僅有個(gè)別組織呈局灶表達(dá)。VEGFR-3的表達(dá)與LVD值呈正相關(guān)關(guān)系，說明VEGFR-3與胃癌淋巴管生成有關(guān)，并由此推測胃癌組織內(nèi)淋巴管生成也可通過胃癌細(xì)胞內(nèi)的VEGFR-3與VEGF-C結(jié)合刺激淋巴管的生成。本研究結(jié)果還顯示，在腫瘤組織周圍間質(zhì)中，部分炎細(xì)胞及纖維細(xì)胞也可見VEGFR-3蛋白表達(dá)，但其作用機(jī)制不祥，有待進(jìn)一步研究。有研究顯示［9］，在腫瘤淋巴管生成過程中，腫瘤組織間質(zhì)中的炎性細(xì)胞也可能發(fā)揮了重要作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，胃癌組中Hp-L型陽性組的LVD值、VEGFR-3的表達(dá)陽性率高于 Hp-L型陰性組，且差異有顯著性（P＜0.05），說明 Hp-L型與胃癌的淋巴管形成有關(guān)，并提示Hp-L型可能是上調(diào)VEGFR-3的表達(dá)從而促進(jìn)胃癌淋巴道轉(zhuǎn)移的發(fā)生。其可能機(jī)制為：1.Hp-L型在體內(nèi)長期存活造成宿主細(xì)胞慢性損傷引起慢性炎癥［10］。炎癥時(shí)炎細(xì)胞釋放的多種炎癥介質(zhì)包括VEGF在內(nèi)的一類血管生長因子可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，誘導(dǎo)淋巴管生成，使組織內(nèi)LVD增加。新生的淋巴管管壁通透性較大，加之內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一些蛋白酶類使腫瘤細(xì)胞容易進(jìn)人微淋巴管而發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移。2.炎性滲出和組織水腫，加上大量增生的腫瘤細(xì)胞可造成局部組織缺氧，而低氧可以介導(dǎo)多種血管、淋巴管生長因子的表達(dá)增加，促進(jìn)淋巴管生成，進(jìn)而表現(xiàn)出LVD的增加［11］。

綜上所述，Hp-L型感染在胃癌的淋巴管生成中具有重要作用，通過檢測 Hp-L型、LYVE-1、D2-40以及VEGFR-3可有助于了解腫瘤的生物學(xué)行為及為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；以VEGFR-3為靶點(diǎn)的基因治療具有新的應(yīng)用前景。

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圖 版 說 明

圖1 Hp-L型在癌旁及癌內(nèi)，主要呈圓球體（革蘭染色 ×1000）

圖2 Hp-L型在胃癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)（SP法×100）

圖3 D2-40在胃癌癌旁間質(zhì)淋巴管的表達(dá)（SP法×100）

圖4 LYVE-1在胃癌內(nèi)間質(zhì)淋巴管的表達(dá)（SP法×100）

圖5 VEGFR-3在胃癌內(nèi)的表達(dá)（SP法×400）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Massive Hp-L in gastric carcinom（Grams staining×1000）

Fig.2Hp-L expressed in gastric carcinom（SP method×100）

Fig.3D2-40protein expressed in gastric carcinom （SP method×200）

Fig.4LYVE-1protein expressed in gastric carcinom （SP method×100）

Fig.5VEGFR-3protein expressed in gastric carcinom （SP method×400）