胡嘉波 胡三強(qiáng) 麻全慧 周中衛(wèi) 王曉慧 張 微

（江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江212013； 1江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京210028）

人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESC）一般是來自人胚胎囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的一種全能性干細(xì)胞，可以在體外無限傳代并保持正常的二倍體核型和多向分化潛能［1－3］。hESC經(jīng)過誘導(dǎo)可分化成為特定組織細(xì)胞，可以潛在用于臨床疾病的細(xì)胞替代治療［4－7］。hESC在體外極易分化，必須在培養(yǎng)基中加入分化抑制因子或?qū)⑵渑囵B(yǎng)在能分泌分化抑制因子的飼養(yǎng)層中［8－9］。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)hESC的自我更新，并且抑制hESC的分化［10－11］。目前實(shí)驗(yàn)室還仍在探索胚胎干細(xì)胞的檢測方法，細(xì)胞化學(xué)染色是常用的組織、細(xì)胞鑒定方法，除了堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色，其他細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)用于研究hESC的報道較少，我們試建立hESC傳代培養(yǎng)方法，觀察hESC及其分化過程中的細(xì)胞化學(xué)染色特性，為進(jìn)一步研究hESC奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材 料

1.1 hESC系

SHhES2［12］由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院／上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所（IHS）金穎博士提供。

1.2 主要試劑

Knockout DMEM、Knockout serum replacement（Knockout SR）、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）為invitrogen公司產(chǎn)品，明膠、β－巰基乙醇、Ⅳ型膠原酶為sigma公司產(chǎn)品，絲裂霉素為Roche公司產(chǎn)品，堿性磷酸酶、過碘酸－雪夫反應(yīng)（periodic acid-Schiff reaction，PAS）、α－醋酸萘酚酯酶（α-naphthol acetate esterase，α-NAE）、過氧化物酶（peroxidase，POX）染色試劑盒為上海太陽生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 0.1%明膠

稱取0.1g明膠粉末，加入100ml雙蒸水配成0.1%的明膠溶液。高壓121℃，30min，明膠全部溶解，室溫保存。

1.4 1g／L Ⅳ型膠原酶

稱取100mgⅣ型膠原酶粉末，溶解到100ml的Knockout DMEM 中，0.22μm濾器過濾除菌。

1.5 絲裂霉素C配制

儲存液：2mg絲裂霉素C加10ml PBS，配制成0.2mg／ml的儲存液，0.22μm 濾器過濾除菌，錫箔紙包裹，避光，4℃保存。應(yīng)用液：吸取0.125ml儲存液，加 2.375ml Knockout DMEM（內(nèi) 含 10%FBS），混勻，配成濃度為10mg／L的應(yīng)用液。

1.6 hESC培養(yǎng)液配制

80%knockout DMEM，20%knockout SR，1 mmol／L L-谷氨酰胺，0.1mmol／Lβ－巰基乙醇，0.1 mmol／L非必需氨基酸，4μg／L bFGF。

1.7 擬胚體培養(yǎng)液配制

不含bFGF的hESC培養(yǎng)液。

2.實(shí) 驗(yàn)方法

2.1 hESC飼養(yǎng)層制備

MEF制備見文獻(xiàn)［13］，P2-P3代 MEF長到鋪滿瓶底80%-90%時，棄培養(yǎng)液，加入含10mg／L絲裂霉素C的培養(yǎng)液，在37℃孵箱培養(yǎng)2h后，用PBS蕩洗5次，每次2min，0.25%胰蛋白酶消化，800r／min，離心5min。MEF培養(yǎng)液重懸，充池計數(shù)，以7×105個細(xì)胞／瓶種到0.1%明膠處理的T25培養(yǎng)瓶中，5%CO2，37℃，飽和濕度培養(yǎng)。24h后，棄MEF培養(yǎng)液，加入適量的hESC培養(yǎng)液，放入孵箱，使MEF適應(yīng)，備用。

2.2 hESC傳代培養(yǎng)

傳代hESC棄培養(yǎng)液，加入適量1g／LⅣ型膠原酶，置37℃孵箱，鏡下觀察，見克隆邊緣卷曲時，棄膠原酶，加入hESC培養(yǎng)液輕輕吹打，800r／min，離心3min，hESC培養(yǎng)液重懸，用滴管輕輕吹打，將hESC團(tuán)吹打成適當(dāng)大小的團(tuán)塊，取出飼養(yǎng)層細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，將已吹打成小團(tuán)塊的hESC按適當(dāng)密度接種于已準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，48h后每日換液，少部分hESC發(fā)生自發(fā)分化，4-5d傳代。

2.3 Giemsa染色

棄hESC培養(yǎng)液，用PBS洗兩次，自然晾干，加甲醇固定約1min，晾干，用Giemsa染色液染色15min，水洗待干。

2.4 擬胚體形成

正常傳代培養(yǎng)的hESC培養(yǎng)5-6d，加入1g／LⅣ型膠原酶37℃消化，當(dāng)克隆完全脫壁時，收集細(xì)胞團(tuán)塊，用擬胚體培養(yǎng)液重懸，種到細(xì)菌培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)，每2d換液一次。

2.5 細(xì)胞化學(xué)染色

取狀態(tài)良好的hESC、自發(fā)分化克隆及擬胚體進(jìn)行 ALP、PAS、α-NAE、POX染色，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，所有染色均未復(fù)染。

結(jié) 果

1.h ESC培養(yǎng)及形態(tài)

hESC在MEF上生長狀態(tài)良好，呈巢狀生長，排列緊密，直徑300-800μm不等，培養(yǎng)4-5d可傳代。hESC單個細(xì)胞體積較小，核大，胞質(zhì)少，核質(zhì)比高，核仁明顯（如圖1）。

2.h ESC及自發(fā)分化克隆細(xì)胞化學(xué)染色

典型hESC的 ALP、PAS、α-NAE染色陽性，POX染色陰性；hESC飼養(yǎng)層 MEF的ALP、PAS、α-NAE、POX染色陰性；hESC自發(fā)分化后，自發(fā)分化克隆邊緣分化細(xì)胞ALP、PAS、α-NAE染色陽性程度明顯減弱，POX染色仍陰性，如圖2。

3.擬 胚體形成

hESC懸浮生長后，2d后開始形成擬胚體，擬胚體呈球形，邊緣光滑，折光性好，較致密。擬胚體ALP染色弱陽性，PAS、α-NAE染色陽性，POX染色仍陰性，如圖3。

討 論

胰蛋白酶分步消化法制備的MEF，P2～P5之間都可以用作hESC飼養(yǎng)層細(xì)胞，能支持hESC的生長并保持hESC未分化的特性［13］。在hESC傳代過程中，比較將MEF先用絲裂霉素C處理然后再凍存和凍存新鮮MEF復(fù)蘇后再用絲裂霉素C處理兩種方法對hESC傳代的影響，兩種MEF保存時間相同，用絲裂霉素C處理后再凍存的MEF狀態(tài)較差，存活時間相對較短，作為飼養(yǎng)層時，hESC易分化。飼養(yǎng)層MEF密度對hESC的狀態(tài)有影響，飼養(yǎng)層較密時，hESC貼壁較慢，并且易形成不貼壁的致密團(tuán)塊，hESC生長速度相對較慢；飼養(yǎng)層較稀時，貼壁后的hESC團(tuán)塊厚度薄，易分化，膠原酶消化后易吹散。在傳代過程中，培養(yǎng)體系bFGF終濃度為0.4μg／L時，添加bFGF前后對飼養(yǎng)層 MEF形態(tài)無明顯變化，hESC易分化；bFGF濃度為4μg／L時，飼養(yǎng)層MEF由不加bFGF時的長條形或者不規(guī)則形變成細(xì)長形，hESC的分化較少（5%以內(nèi)），說明bFGF可能通過影響飼養(yǎng)層狀態(tài)而間接影響hESC的生長。在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，hESC經(jīng)過30次以上的傳代，hESC克隆形態(tài)上保持不變。

細(xì)胞化學(xué)染色是細(xì)胞學(xué)和化學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)，它以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合運(yùn)用化學(xué)反應(yīng)對細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)物質(zhì)作定性、定位、半定量的分析。常見的細(xì)胞化學(xué)染色法有ALP、PAS、α-NAE、POX染色等，目前主要用于血液細(xì)胞的鑒別，對血液疾病的診斷和鑒別診斷具有重要意義。ALP是一種單脂磷酸水解酶，主要功能是破壞生物氧化過程中有劇毒的過氧化物，使其釋放氧，參加細(xì)胞內(nèi)氧化還原過程。ALP高表達(dá)與干細(xì)胞未分化特性相關(guān)，未分化hESC表達(dá)豐富，在已分化的hESC中表達(dá)減少或消失，ALP染色可作為檢測hESC未分化狀態(tài)的一個重要標(biāo)志［14］。PAS染色可顯示糖原，主要檢測組織、細(xì)胞內(nèi)的多糖成分，有報道hESC PAS染色陽性［15］。酯酶是一組具有較大pH范圍的水解酶類，按其對不同脂肪酸水解選擇性不同，可分為非特異性酯酶和特異性酯酶兩大類，α-NAE是一種非特異性酯酶，一般外周血單核細(xì)胞含量豐富。POX是外周血中性粒細(xì)胞含量最多的一種蛋白質(zhì)。我們的結(jié)果顯示：hESC ALP染色陽性，自發(fā)分化克隆及形成擬胚體后，陽性程度減弱；hESC PAS、α-NAE染色陽性，自發(fā)分化克隆邊緣細(xì)胞PAS、α-NAE含量明顯減低，最邊緣甚至呈陰性；hESC POX染色陰性，自發(fā)分化克隆及形成擬胚體后仍保持陰性，說明hESC及早期分化階段POX幾乎無活性。

MEF能支持hESC傳代培養(yǎng)，hESC細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，揭示了hESC細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)組成特征，為鑒別、進(jìn)一步研究hESC特性奠定了基礎(chǔ)。

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圖 版 說 明

圖1 人胚胎干細(xì)胞形態(tài)A：倒置相差顯微鏡（×100）；B：倒置相差顯微鏡（×200）；C：Giemsa染色（×100）；D Giemsa染色（×200）

圖2 人胚胎干細(xì)胞及人胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化克隆的細(xì)胞化學(xué)染色（×100）A、B、C、D：分別為人胚胎干細(xì)胞ALP、PAS、α-NAE、POX染色；E、F、G、H：分別為人胚胎干細(xì)胞自發(fā)分化克隆 ALP、PAS、α-NAE、POX染色

圖3 擬胚體細(xì)胞化學(xué)染色（×100）A：未染色；B：ALP；C：PAS；D：α-NAE；E：POX

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Morphology of human embryonic stem cells A：inverted phase contrast microscope（×100）；B：inverted phase contrast microscope（×200）；Giemsa stain（×100）；D Giemsa stain（×200）

Fig.2Cytochemical stainning of human embryonic stem cells and spontaneously differentiated colonies of human embryonic stem cells（×100）A、B、C、D：ALP，PAS，α-NAE and POX cytochemical stain for human embryonic stem cells；E、F、G、H：ALP，PAS，α-NAE and POX cytochemical stain for spontaneously differentiated colonies of human embryonic stem cells

Fig.3cytochemical stain for embryoid body（×100）A ：unstained；B：ALP；C：PAS；D：α-NAE；E：POX