單士剛，包永芬，陳賢均

(咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧437100)

體外基因表達(dá)系統(tǒng)包括原核細(xì)胞系統(tǒng)和真核細(xì)胞系統(tǒng)。原核細(xì)胞系統(tǒng)主要是大腸桿菌細(xì)胞系。真核細(xì)胞系統(tǒng)包括哺乳動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)。其中昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，即桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BEVS)，因其獨(dú)特的生物學(xué)特性，在過去的20年里，已作為一種真核表達(dá)載體被廣泛應(yīng)用。本研究就該系統(tǒng)的主要特性、種類以及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用等方面進(jìn)行闡述。

1 桿狀病毒及其表達(dá)系統(tǒng)

桿狀病毒是一類專門寄生于節(jié)肢動物的病原微生物。目前全世界已發(fā)現(xiàn)600多種桿狀病毒，其中研究最深入的是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)。AcNPV病毒粒子成桿狀，病毒囊膜直接包被著約130 kb的雙鏈、環(huán)狀DNA分子，其全基因組序列已經(jīng)測定清楚。20世紀(jì)80年代后期昆蟲桿狀病毒已被成功開發(fā)作為一種基因表達(dá)的載體，即昆蟲桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)。目前其被廣泛應(yīng)用于外源目的基因的表達(dá)。由于利用真核的昆蟲幼蟲或昆蟲細(xì)胞作為宿主，其表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠進(jìn)行正確的轉(zhuǎn)錄后加工;桿狀病毒基因組本身較大且可操作性好，可以容納多個(gè)基因或較大的基因，而且桿狀病毒在自然條件下不能感染脊椎動物，生物安全性好，這些優(yōu)點(diǎn)使桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)成為一項(xiàng)比較成熟、安全、經(jīng)濟(jì)、高效的蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)［1］。經(jīng)歷幾十年的發(fā)展，圍繞擴(kuò)大桿狀病毒表達(dá)體系的應(yīng)用范圍，科學(xué)家們對此體系進(jìn)行了一系列的改造。截止到目前，已有19種商品化的桿狀病毒表達(dá)體系得到廣泛應(yīng)用［2］。

2 桿狀病毒表達(dá)體系在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2.1 作為基因治療載體 到目前為止人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)27種非人類病毒載體可用于臨床疾病的治療［3］，其中桿狀病毒是非復(fù)制型載體，且重組桿狀病毒載體具有容量大、易操作、易純化和安全性高的特點(diǎn)，因而是一種很有應(yīng)用前景的基因轉(zhuǎn)移載體［4］。自首次報(bào)道運(yùn)用桿狀病毒介導(dǎo)的p53基因治療骨肉瘤以來，已有許多利用桿狀病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)進(jìn)行心血管、前列腺、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病的治療研究。新近發(fā)現(xiàn)桿狀病毒還是潛在的、長期的、高效的體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因載體。Pieroni等將桿狀病毒注射到不同鼠種的后四頭肌中時(shí)，報(bào)告基因得到了表達(dá)，一些鼠種的報(bào)告基因甚至表達(dá)了35～178 d。這使桿狀病毒在基因治療方面更具有應(yīng)用潛力。最近，有研究肯定了用含有白喉毒素基因的桿狀病毒對于神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的效果［5］;通過桿狀病毒介導(dǎo)在人胚胎干細(xì)胞內(nèi)也獲得了瞬間和穩(wěn)定的基因表達(dá)［6］，并且研究表明桿狀病毒能夠作為用于干細(xì)胞和骨組織工程中的新型基因轉(zhuǎn)移載體［7，8］。為了更好地發(fā)揮桿狀病毒在哺乳細(xì)胞中的作用，有學(xué)者對桿狀病毒載體進(jìn)行了改良。用含有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和綠色熒光報(bào)告基因(gfp)的病毒進(jìn)行有效的桿狀病毒介導(dǎo)性轉(zhuǎn)導(dǎo)，已在一系列細(xì)胞系和原代培養(yǎng)物中證實(shí);另一種能有效并穩(wěn)定地將重組基因?qū)爰?xì)胞的桿狀病毒載體也已報(bào)道。這種病毒含有1對表達(dá)盒(B-gal和潮霉素抗性)，并以來自腺病毒伴隨病毒(AAV)的倒置末端重復(fù)序列(ITR)為側(cè)翼［9］。

總之，重組桿狀病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞已經(jīng)得到廣泛證實(shí)。桿狀病毒通過一種尚未闡明的侵入機(jī)制，使其成為一個(gè)能對許多哺乳動物細(xì)胞系進(jìn)行高效轉(zhuǎn)移的載體。但許多問題，特別是體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其機(jī)制等需要進(jìn)一步研究和解決。

2.2 作為基因表達(dá)載體用于疫苗研制 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)由于其不具有任何對哺乳動物有潛在致病性的動物病毒片段，得到了人們的高度重視，被越來越多的應(yīng)用于多肽藥物和疫苗研制方面［10］。目前，桿狀病毒表達(dá)載體已用于多種疫苗的生產(chǎn)研制，主要集中于病毒和寄生蟲疫苗，如HIV疫苗已于20世紀(jì)80年代進(jìn)入臨床，瘧疾疫苗已于20世紀(jì)90年代進(jìn)入臨床。與這兩種疫苗相比，針對細(xì)菌感染的基因工程疫苗則研究報(bào)道較少。相信隨著時(shí)間的推移，BVES系統(tǒng)用途會得到更大擴(kuò)展。

2.3 作為生物納米材料 近幾年來的研究致力于將生物學(xué)的工具用于納米科技領(lǐng)域，即將生物學(xué)應(yīng)用于納米科技，從而產(chǎn)生了生物納米技術(shù)。生物學(xué)材料可能是仿生納米級物體的獨(dú)特工具，有序的納米級生物分子是仿生無機(jī)納米結(jié)構(gòu)很好的模板。利用生物病毒開發(fā)納米生物技術(shù)是近年引人注目、迅速發(fā)展的一個(gè)領(lǐng)域。桿狀病毒自身具有納米級結(jié)構(gòu)，因此成為生物納米技術(shù)領(lǐng)域中非常誘人的建筑材料。目前雖然有關(guān)利用昆蟲桿狀病毒應(yīng)用于納米領(lǐng)域的報(bào)道還不多，但已出現(xiàn)一些新的研究動向，如應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)SV40核衣殼蛋白，使之進(jìn)行自我組裝，成為一個(gè)能夠輸送生物活性物質(zhì)的納米膠囊［11］，有望應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域。利用桿狀病毒產(chǎn)生類似于犬細(xì)小病毒新的納米材料，應(yīng)用于腫瘤的治療［12］。

2.4 用于表達(dá)免疫活性分子和重組藥物蛋白 桿狀病毒表達(dá)載體自問世以來，由于其不具任何對哺乳動物有潛在的致病性的動物病毒片段，表達(dá)的產(chǎn)物成本低、表達(dá)量高、構(gòu)象接近天然蛋白等特點(diǎn)，因此可用于免疫活性分子和重組藥物蛋白(如抗原、抗體、生長因子、酶、干擾素等)的大量生產(chǎn)。自1983年首次表達(dá)IFN-β以來，已經(jīng)表達(dá)了(如生長因子、酶、干擾素等)大量活性免疫分子和重組藥用蛋白，且具有廣泛的應(yīng)用和市場前景。近來，Machado等［13］成功表達(dá)了漢坦病毒核蛋白，可用于血清學(xué)檢測。

2.5 用于基于細(xì)胞的藥物篩選 長期以來對乙肝病毒的研究由于缺乏一種合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)而受到限制，為此Delaney等［14］發(fā)展了一種新的體外表達(dá)系統(tǒng)。他們將具有復(fù)制性的HBV基因組重組至AcMNPV，用此重組AcMNPV介導(dǎo)HBV基因組進(jìn)入HepG2細(xì)胞系并使其得到高水平復(fù)制和表達(dá)，由此構(gòu)建HBV-AcMNPV-HepG2表達(dá)系統(tǒng)。并運(yùn)用此系統(tǒng)評價(jià)了抗病毒藥物拉米夫定對HBV復(fù)制及共價(jià)閉合環(huán)狀DNA聚集的影響。隨后Delaney等［15］又將HBV耐藥株重組至AcMNPV，并用此重組病毒測試了HBV耐藥株對不同藥物的交叉耐藥性。Adelhamed等［16］報(bào)道采用HBV-桿狀病毒系統(tǒng)對拉米夫定和Clevudine的抗HBV效果進(jìn)行了比較。

總之，桿狀病毒表達(dá)載體具有基因容量大、操作性好、表達(dá)效率高、生物安全性好、靶向性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究中應(yīng)用越來越廣泛，對醫(yī)學(xué)研究具有重要指導(dǎo)意義。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，BEVS的研究必將更加深入、完善。

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