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[摘要]目的：探討VEGF在不同皮膚擴(kuò)張方式中的表達(dá)與擴(kuò)張皮瓣中新生血管的形成關(guān)系，建立適合于臨床的最佳的皮膚擴(kuò)張方式。方法：選用62只新西蘭大白兔隨機(jī)分為5大組，隨機(jī)將動(dòng)物按不同擴(kuò)張方式分為5組：A組（反復(fù)快速擴(kuò)張組）、B組（快速擴(kuò)張組）、C組（常規(guī)擴(kuò)張組）、D組（植入不擴(kuò)組）、E組（正常對照組），采用免疫組織化學(xué)染色觀察擴(kuò)張皮瓣中VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果：在維持1周，A組的VEGF表達(dá)明顯高于B組和C組（P<0.05），B組與C組差異不明顯（P>0.05）；在維持2、3、4周A組與B組、C組比較均無顯著性差異（P>0.05）；在維持6周，A組的VEGF表達(dá)與B組比較無顯著性差異（P>0.05）；維持6周的A組和B組的VEGF表達(dá)明顯高于維持4周的C組（P<0.05）。結(jié)論：反復(fù)快速皮膚擴(kuò)張可明顯提高擴(kuò)張皮瓣中VEGF的合成與分泌，促進(jìn)血管形成。

[關(guān)鍵詞]皮膚擴(kuò)張術(shù)；血管生成；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）

[中圖分類號(hào)]R622R332[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）10-0-0

目前皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)已廣泛應(yīng)用于整形外科中[1-6]，成為整形外科的重要治療手段和常用的基本技術(shù)。臨床上應(yīng)用最多的擴(kuò)張方式為常規(guī)擴(kuò)張方式。但此法療程較長、并發(fā)癥多[7-12]。國內(nèi)外學(xué)者對此發(fā)展了各種快速擴(kuò)張方式[13-16]，這些方法均不同程度上縮短了療程，但可能導(dǎo)致組織壞死，還存在諸如回縮率較高、操作繁瑣、設(shè)備昂貴等弊端。近年微創(chuàng)技術(shù)的出現(xiàn)有效減少了并發(fā)癥[17]。本研究結(jié)合目前臨床常用的常規(guī)擴(kuò)張法與快速擴(kuò)張法的特點(diǎn)，擬采用一種新型的皮膚軟組織擴(kuò)張方式-反復(fù)快速皮膚擴(kuò)張，通過對新西蘭大白兔皮膚擴(kuò)張，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法，觀察反復(fù)快速皮膚擴(kuò)張對皮瓣血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)的影響，并探討建立更適應(yīng)于臨床的皮膚擴(kuò)張方式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：62只雄性新西蘭大白兔，6月齡，體重2～3kg，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，冀醫(yī)動(dòng)管字610063號(hào)。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，統(tǒng)一飼料，自由飲食。

1.2 動(dòng)物分組：隨機(jī)將動(dòng)物按不同擴(kuò)張方式分為5組：A組（反復(fù)快速擴(kuò)張組）、B組（快速擴(kuò)張組）、C組（常規(guī)擴(kuò)張組）、D組（植入不擴(kuò)組）、E組（正常對照組），A、B組每組20只動(dòng)物，C組16只動(dòng)物，D組5只動(dòng)物，E組1只動(dòng)物。

1.3 皮膚擴(kuò)張動(dòng)物模型制備：手術(shù)區(qū)備皮，術(shù)前稱量體重，2.5g/L戊巴比妥鈉（25mg/Kg）于耳緣靜脈注射行全身麻醉。麻醉顯效后，常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)、鋪無菌巾。自兩耳根后緣連線間，橫行切開長約2.5cm皮膚切口，切開皮膚及皮下組織，血管鉗向前鈍性分離頭部皮膚與顱骨骨膜的疏松附著，分離范圍：兩側(cè)近眶骨上緣1cm，前部距鼻翼2cm處。自皮膚切口處，于植入腔內(nèi)植入容量為50ml的腎形擴(kuò)張器，上海東月醫(yī)療保健用品有限公司產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)：050301。植入前自注射壺注射無菌生理鹽水檢查擴(kuò)張器有無滲漏。注射壺埋入頸部皮下，嚴(yán)密縫合皮膚切口。自注射壺注入無菌生理鹽水5ml。術(shù)畢即刻肌肉注射慶大霉素8萬單位，術(shù)后每日肌肉注射慶大霉素8萬單位至術(shù)后3天。擴(kuò)張器植入術(shù)后第3天開始擴(kuò)張皮膚（見圖1）。

1.3.1 A組：每日擴(kuò)張1次；每次自注射壺注入無菌生理鹽水20ml， 維持30min；然后抽出全部注入液體，間隔3h；照上述方法反復(fù)3次，最后一次抽出15ml液體，擴(kuò)張器內(nèi)留置5ml無菌生理鹽水。每日重復(fù)上述步驟，10日完成注水。

1.3.2 B組：每日擴(kuò)張1次；每次自注射壺注入無菌生理鹽水5ml，10日完成注水。

1.3.3 C組：每3日擴(kuò)張1次；每次自注射壺注入無菌生理鹽水5ml，28日完成注水。

1.4 標(biāo)本采集與處理：A、B組分別于擴(kuò)張完成后維持1周、2周、3周、4周、6周；C組分別于擴(kuò)張完成后維持1周、2周、3周、4周隨機(jī)抽取4只動(dòng)物留取標(biāo)本。D組分別于植入擴(kuò)張器后1周、2周、3周、4周、6周隨機(jī)抽取1只動(dòng)物留取標(biāo)本。修剪表面毛發(fā)后，全麻下于擴(kuò)張皮瓣中央處切取約1cm×1cm大小的擴(kuò)張全層皮膚組織塊。投入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成4μm連續(xù)切片。進(jìn)行VEGF免疫組織化學(xué)觀察。

1.5 VEGF陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：VEGF表達(dá)主要見于細(xì)胞漿內(nèi)，表現(xiàn)為棕黃色顆?；螯S褐色顆粒分布于胞漿中。VEGF陽性表達(dá)以胞漿胞膜有棕黃色顆粒為準(zhǔn)。VEGF在上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)。

1.6 VEGF含量的判定：采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)在高倍鏡下（200×）沿皮膚紋路隨機(jī)選取5個(gè)不同的皮膚組織區(qū)域，測定其陽性細(xì)胞所占比例，以陽性細(xì)胞染色的積分光度值（integrated optical density， IOD）來表示抗原表達(dá)量。陽性染色的積分光度越高，說明陽性細(xì)胞數(shù)量越多。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：VEGF計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示，運(yùn)用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 一般情況：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未出現(xiàn)感染、擴(kuò)張器外露、皮瓣壞死等并發(fā)癥，均成活到預(yù)定觀察時(shí)間。

2.2HE染色組織學(xué)觀察：A、B、C組：維持1、2周時(shí)，微血管明顯增生，排列密集，管腔較小，圓形或類圓形，主要集中于真皮乳頭層、網(wǎng)狀層以及毛囊周圍；維持4周時(shí)，血管數(shù)量較多，排列較密集，管腔較大。

D組：血管增生不明顯，管腔明顯，排列比較稀疏，可見一些小血管稀疏排列在真皮淺層、網(wǎng)狀層和毛囊周圍。

2.3VEGF的表達(dá)：VEGF的染色特點(diǎn)：VEGF的陽性定位于細(xì)胞的胞漿，反應(yīng)物質(zhì)呈黃色顆粒狀，表達(dá)較強(qiáng)時(shí)為棕黃色。VEGF主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞亦可以見陽性染色，在毛囊細(xì)胞及皮脂腺細(xì)胞也可見表達(dá)（見圖2～3）。

A、B、C三組在維持1周VEGF的表達(dá)均處于較高水平（見圖4），隨著維持時(shí)間的延長，VEGF的表達(dá)呈下降趨勢，在維持4周時(shí)（見圖5），VEGF的表達(dá)接近正常皮膚的水平，而后再次升高（表1）。

在維持1周，A組的VEGF表達(dá)明顯高于B組和C組（P<0.05），B組與C組差異不明顯（P>0.05）；在維持2、3、4周，A組與B組、C組比較均無顯著性差異（P>0.05）；在維持6周，A組的VEGF表達(dá)與B組比較無顯著性差異（P>0.05）；維持6周的A組、B組VEGF表達(dá)明顯高于維持4周的C組（P<0.05）（表2）。

3討論

3.1 VEGF也稱血管通透性因子（vascular permeability factor， VPF）或促血管素，最初是由培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種新型生長因子，能增加微小血管通透性。隨后發(fā)現(xiàn)該因子能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖，因此命名為VEGF。VFGF通過和血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，具有促內(nèi)皮增殖、促血管生成作用，其它血管生成因子的血管生成作用是全部或部分通過增強(qiáng)VFGF的表達(dá)及生成作用實(shí)現(xiàn)的。VFGF的生物學(xué)特性主要表現(xiàn)在兩方面：增加微血管的通透性和特異性的與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖進(jìn)而導(dǎo)致新生血管的生成。

3.2 擴(kuò)張后擴(kuò)張皮膚微血管的變化是一個(gè)復(fù)雜的過程，受內(nèi)皮細(xì)胞生長因子等多種血管活性因子的影響。早期研究表明在擴(kuò)張的組織中細(xì)胞活性增加[18-19]。擴(kuò)張時(shí)增加了皮膚局部缺血、缺氧程度[18，20-21]，局部缺血造成VEGF的合成、分泌增加。皮膚擴(kuò)張除可產(chǎn)生額外的皮膚組織，且能明顯促進(jìn)血管增生。Lantieri等[22]采用免疫組織化學(xué)方法，首次發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張皮膚組織內(nèi)VEGF表達(dá)增多，在真皮淺層、毛囊及皮脂腺均可見強(qiáng)烈表達(dá)，證明在組織擴(kuò)張時(shí)局部缺血誘導(dǎo)產(chǎn)生VEGF可能是組織擴(kuò)張中血管發(fā)生的一個(gè)機(jī)制。

3.3 本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，皮膚組織在受到擴(kuò)張刺激后，VEGF合成與釋放增加，三種擴(kuò)張方式均可造成擴(kuò)張皮膚組織中VEGF的高表達(dá)。三組擴(kuò)張皮膚組織中VEGF的高表達(dá)在維持前期保持在較高水平，在維持期2周時(shí)表現(xiàn)為急速下降趨勢，以后呈平穩(wěn)下降趨勢，在維持期4周時(shí)，VEGF的表達(dá)下降至正常水平?？赡艿脑颍洪L期的缺血、缺氧致細(xì)胞的代償性活性增強(qiáng)，VEGF合成、分泌增加，至維持期第2周時(shí)，失代償后細(xì)胞凋亡，VEGF合成、分泌減少；造成VEGF的表達(dá)在維持期2周時(shí)的急速下降趨勢。折線圖中顯示反復(fù)快速擴(kuò)張組的VEGF表達(dá)高于快速擴(kuò)張組和常規(guī)擴(kuò)張組。表明：反復(fù)快速擴(kuò)張的刺激，增加了組織細(xì)胞的活性，促進(jìn)了VEGF合成、分泌的增加，而VEGF分泌的增加，又進(jìn)一步促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促使擴(kuò)張皮瓣中血管增生。隨著維持時(shí)間的延長，局部缺血、缺氧程度逐漸減輕，VEGF的表達(dá)趨于正常水平。

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[收稿日期]2012-06-28[修回日期]2012-08-27

編輯/張惠娟