樊明山

預(yù)防和延緩皮膚衰老已成為美容研究的熱點(diǎn)。自從20世紀(jì)80年代開展了生長因子在組織修復(fù)中的作用研究后，特別是外源性生長因子的應(yīng)用，著眼于提高機(jī)體自身的自我修復(fù)能力，從某種意義上，使皮膚抗衰老的治療也在觀念上有了更新。富血小板血漿（Platelet-rich Plasma ，PRP）凝膠應(yīng)用于面頸部皮膚抗衰老的方法，就是這一觀念的體現(xiàn)。本文就PRP凝膠在皮膚抗衰老方面的作用機(jī)制研究綜述如下。

1皮膚衰老的機(jī)制及病理生理改變

1.1皮膚衰老的機(jī)制：皮膚衰老通常分為內(nèi)源性衰老和外源性衰老，前者主要表現(xiàn)為自然衰老形式，后者主要因環(huán)境因素，如：紫外線輻射、吸煙、風(fēng)吹及接觸有毒化學(xué)物質(zhì)引起，但主要表現(xiàn)為“光老化”形式。

內(nèi)源性皮膚衰老的過程很大程度上受多種特異基因的影響。同種生物內(nèi)部微小的基因變化（如：單核苷酸多態(tài)性）可以影響該個(gè)體在各個(gè)年齡段的老化速度；老化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞有三種表型：①細(xì)胞不可逆的抑制DNA的合成；②細(xì)胞凋亡的抵抗；③不同功能表達(dá)的變化。Spiring等[1]實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DNA復(fù)制與衰老相關(guān)，他們在皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了DNA合成抑制因子，它通過抑制細(xì)胞DNA合成引起細(xì)胞復(fù)制速度減慢，錯(cuò)誤率上升，最終導(dǎo)致基因突變。同時(shí)，細(xì)胞αDNA變異或缺損的修復(fù)能力下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰亡。另有研究證明，皮膚衰老與真皮膠原蛋白的含量和性質(zhì)有關(guān)，隨著年齡的增長，控制DNA合成的抑制物增多，致使rRNA、tRNA、mRNA含量逐漸下降，蛋白合成進(jìn)一步減少，由于蛋白降解亦相應(yīng)減少，結(jié)果膠原量減少并老化[2-3]。外源性皮膚衰老以日光中的紫外線（UV）所造成的皮膚“光老化”最為顯著，照射早期，成纖維細(xì)胞由合成膠原纖維轉(zhuǎn)而合成彈力纖維；中期網(wǎng)狀纖維增生，新合成膠原纖維增多，又因UV引起真皮炎性浸潤，浸潤的單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞釋放蛋白水解酶，使成熟膠原進(jìn)一步減少，整體膠原由Ⅰ型向Ⅲ型膠原轉(zhuǎn)變。另外，真皮彈力纖維吸收UV發(fā)生彈力纖維蛋白變性，纖維增粗，聚集成團(tuán)。這樣，皮膚就呈現(xiàn)“光老化”的增生表現(xiàn)，晚期則呈現(xiàn)“萎縮”狀態(tài)[4-6]。

在皮膚衰老的外源性因素中，除UV外，外傷、感染、空氣污染、吸煙等均可造成皮膚大分子損傷，被稱為“衰老因素”。其共同的機(jī)制是直接或間接地誘導(dǎo)機(jī)體微循環(huán)炎癥系統(tǒng)的某個(gè)環(huán)節(jié)，引起炎癥反應(yīng)，又打破微循環(huán)炎癥系統(tǒng)的自身平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞外變性分子堆積，造成皮膚細(xì)胞的隨機(jī)損傷[7]。

1.2皮膚衰老的病理生理改變：皮膚衰老是在漫長的生命過程中日積月累逐漸形成的，從時(shí)間順序上內(nèi)源性衰老和外源性衰老疊加在一起，很難將兩者準(zhǔn)確區(qū)分，其病理生理改變也基本一致。

在病理方面，皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞生長緩慢，皮膚增生能力減退，皮膚變薄。真皮中成纖維細(xì)胞合成膠原纖維，彈力纖維，氨基多糖和蛋白多糖等基質(zhì)減少，真皮萎縮，皮膚松弛，過度伸展后出現(xiàn)皺紋，深部毛細(xì)血管擴(kuò)張，慢性真皮缺血，皮膚暗啞無光澤或呈灰黃色。在生理方面，表皮更替速率下降，防護(hù)性屏障功能減退，角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生白介素和其他細(xì)胞生長因子能力下降，表皮修復(fù)角質(zhì)層所需的時(shí)間隨年齡增加而延長，皮脂腺功能減退，皮脂分泌減少，DNA修復(fù)能力下降，皮膚免疫功能降低，皮膚內(nèi)防護(hù)性酶（SOD，谷胱甘肽過氧化物酶）活性降低，對(duì)自由基清除能力下降，促進(jìn)皮膚衰老[8]。

2富血小板血漿（PRP）

PRP是通過離心自體全血而得到的高濃度血小板血漿。其中富含多種生長因子，如血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）、胰島素樣生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等。它的血漿成分中存在三種蛋白質(zhì)：纖維素、纖粘連蛋白及親玻粘連蛋白。這些生長因子對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，增加膠原合成能力，促進(jìn)基質(zhì)合成和沉降及組織的形成有著極其重要的作用，并且生長因子之間有良好的協(xié)同作用[9-10]。

2.1 PRP的制備及激活： PRP的制作就是將抽取于自體靜脈的全血通過離心的方法從中提取高濃度血小板血漿。目前制作的方法很多，按其制備程序，可分為一次離心法，二次離心法和三次離心法，大量實(shí)驗(yàn)證明：一、二次離心法PRP 的提取率最高，臨床應(yīng)用也最廣。其基本原理是根據(jù)血液中各組分的沉降系數(shù)不同，在第一次離心后將血液分成三層，最底層是沉降系數(shù)最大的紅細(xì)胞，最上層是上清層，交界處有一薄層肉眼不易區(qū)分，即富血小板層。二次離心的原理在于，第一次離心后，棄去上清層或紅細(xì)胞層，然后改變離心力再次離心，使更多的血小板分離出來。不同離心力，離心次數(shù)和離心時(shí)間制作的PRP中血小板和生長因子濃度不相同[11]。Landesberg[12]以不同的離心力和離心時(shí)間二次離心制作PRP，發(fā)現(xiàn)如果離心力大于250g，會(huì)導(dǎo)致血小板破壞過多。如果第一次離心時(shí)間少于5min，得到的PRP中血小板濃度與全血無顯著性差異，建議第一次離心后棄去紅細(xì)胞，兩次離心均采用200g力離心10min較好，PRP血小板濃度為全血的6.17倍。而Marx[13]認(rèn)為，PRP的制作第一次需要高速離心，第一次離心后，紅細(xì)胞和上清交界面以下2mm血小板濃度最高，棄去上清后再低速離心，這樣可以更好地提取血小板[14]。

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，第一次低速離心后，吸取全部上清和交界面下的一部分紅細(xì)胞層于另一支離心管，再次以高速離心，所得PRP中血小板回收率較高。Sonnleither[15]第一次離心160g力離心20min后，發(fā)現(xiàn)交界面下6mm血小板濃度最高，并且第二次離心400g力離心15min后，檢測試管底部的血小板濃度超過2000 000/nl，達(dá)正常血小板濃度的近10倍。無論以何種方法分離PRP，都須進(jìn)一步制備成PRP凝膠以激活濃縮的血小板后，α顆粒才能釋放高濃度的各種生長因子，發(fā)揮組織修復(fù)作用。PRP凝膠是PRP與氯化鈣和凝血酶混合而成的一種具有粘性的膠狀凝塊，目前已被證實(shí)最好的PRP激活劑是由氯化鈣和凝血酶混合制成，在使用前，PRP與激活劑按一定比例搖晃均勻，即成PRP凝膠，可直接注射植入所需局部進(jìn)行治療。另外，血小板在體外非常脆弱，在血液中流失很快，在注射過程中由于注射針頭太小，推擠壓力過大會(huì)損壞血小板外衣而破壞血小板。PRP凝膠相當(dāng)于給血小板穿上了一層外衣，可保護(hù)血小板在體外不受損害，防止血小板的流失，使血小板在局部長時(shí)間停留，并分泌高濃度生長因子，PRP凝膠還有一定的可塑性，有利于填充塑形的美容治療。

2.2 PRP在皮膚組織損傷修復(fù)中的作用機(jī)制：PRP凝膠植入衰老受損的皮膚組織后，多種高濃度生長因子被激活，引起一系列皮膚細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，抵抗DNA合成抑制因子，促發(fā)相應(yīng)的基因表達(dá)而起作用。

PDGF是由血小板的α顆粒和巨噬細(xì)胞合成的糖蛋白，主要通過與成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的α受體結(jié)合，激活衰老受損局部細(xì)胞的有絲分裂，增加細(xì)胞基質(zhì)產(chǎn)物，使再生細(xì)胞增多[16]。研究證實(shí)在受損傷部位的成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有PDGFmRNA 的表達(dá)。因此，PDGF能夠增加損傷部位成纖維細(xì)胞向肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使損傷組織膠原蛋白的合成量增加，促成組織的生長修復(fù)[17-18]。

TGFβ也是一種糖蛋白，主要由血小板和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。TGFβ參與體內(nèi)許多炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)，是體內(nèi)多功能的基礎(chǔ)抗炎細(xì)胞因子。TGFβ的含量與膠原的合成、損傷愈合的時(shí)間，損傷愈合組織的張力等有一定的關(guān)聯(lián)。有研究表明，組織損傷后的炎癥前期，局部相關(guān)的細(xì)胞因子有所增加，而TGFβ水平暫時(shí)下降，膠原沉積減少。TGFβ既可直接作用于成纖維細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白合成，也可使體外低濃度的TGFβ刺激成纖維細(xì)胞合成大量的膠原基質(zhì)，從而促進(jìn)損傷修復(fù)[19]。EGF（表皮生長因子）是血小板分泌的PDGF激活巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，由活化的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。EGF與受體結(jié)合后發(fā)揮活性，EGF受體（EGFR）幾乎在所有細(xì)胞都有表達(dá)，但以表皮細(xì)胞最為豐富。皮膚損傷后，局部使用PRP凝膠后可釋放EGF，EGF不僅加速表皮生長，而且有增加基質(zhì)形成和結(jié)締組織收縮的作用。動(dòng)物切割傷模型已證實(shí)外用EGF能加速表皮生長，并增加傷口愈合張力[20]。血管內(nèi)皮生長因子包括VEGFA、B、C、D、E和胎盤生長因子，具有促進(jìn)血管新生及增強(qiáng)血管通透性的作用，是軟組織中微血管修復(fù)中的重要生長因子。FGF能促進(jìn)中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞的有絲分裂，多種組織的發(fā)生發(fā)展均受到FGF的影響。能促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，使細(xì)胞從G0期向G1期轉(zhuǎn)化、增殖，產(chǎn)生大量的膠原和成纖維細(xì)胞，構(gòu)成組織外基質(zhì)，促進(jìn)組織的修復(fù)。IGF，包括IGF1和IGF2。IGF2研究的較少，IGF1可以與PDGF協(xié)同作用增加表皮和內(nèi)皮的再生[21]。PRP血漿成分中含有的纖維素，纖粘連蛋白及親玻粘連蛋白將血小板釋放的生長因子聚集在局部發(fā)揮作用。還能作為新生細(xì)胞和組織的支架促進(jìn)衰老皮膚的修復(fù)。

在實(shí)驗(yàn)與臨床研究中，PRP在皮膚衰老方面的研究報(bào)道少之又少，但對(duì)皮膚損傷愈合修復(fù)作用的研究報(bào)道還是較多的，在這些報(bào)道中，均證實(shí)PRP表現(xiàn)出良好的修復(fù)作用。王悅等[22]用PRP體外培養(yǎng)人真皮纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PRP能加速靜止（G1/G0）細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，從而促進(jìn)細(xì)胞數(shù)量的增加。PRP對(duì)hDFbs有促進(jìn)增殖作用。袁霆等[23]用PRP凝膠修復(fù)皮膚缺損，PRP組皮膚更顯成熟，皮膚真皮層纖維排列較對(duì)照組整齊。Ceovetti用PRP治療皮膚潰瘍，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)PRP能很好地在傷口處形成肉芽組織，促進(jìn)傷口上皮組織完全再生[24]。Marx用PRP凝膠和凝血酶作對(duì)照修復(fù)全層皮膚缺損，結(jié)果顯示，術(shù)后第7、14、20、30天，PRP凝膠組傷口的上皮形成率分別為91%、95%、100%、100%，而凝血酶組上皮形成率為4%、15%、38%、69%。PRP凝膠的傷口愈合遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。根據(jù)皮膚衰老的機(jī)制和病理生理改變，這些生長因子具有影響老化速度、逆轉(zhuǎn)抑制DNA合成、抵抗細(xì)胞衰亡和加強(qiáng)組織細(xì)胞功能表達(dá)的重要作用。由此推斷，PRP與皮膚抗衰老之間呈正相關(guān)關(guān)系。

3富血小版血漿在皮膚抗衰老中的展望

PRP中含有多種高濃度的生長因子，由于PRP來源于自體全血，各生長因子間的比例與體內(nèi)正常比例相符，使生長因子之間有最佳的協(xié)同作用，在一定程度上彌補(bǔ)了單一生長因子激活修復(fù)不佳的缺點(diǎn)，且不會(huì)出現(xiàn)外源性生長因子的免疫排斥，也不會(huì)有異體移植中存在的傳播疾病的危險(xiǎn)。PRP在激活劑的激活下形成凝膠狀，可以保護(hù)血小板在注射植入中受損，防止血小板流失，使血小板在局部長時(shí)間分泌生長因子，保持較高的生長因子濃度，避免了外用液態(tài)生長因子外擦易流失、易蒸發(fā)和作用時(shí)間短的缺點(diǎn)。PRP凝膠在皮膚抗衰老修復(fù)中，不僅承載了多種高濃度生長因子，而且因?yàn)樗誓z狀，具有一定的可塑性，對(duì)皮膚皺紋、凹洞、皮膚松弛等均有良好的填充支撐作用。另外，PRP的血清中還含有大量的細(xì)胞粘合蛋白：纖維素、纖粘連蛋白和親玻粘連蛋白，為皮膚修復(fù)提供了良好的3D立體結(jié)構(gòu)支架，還可以收緊松弛的皮膚。

因此，利用PRP技術(shù)把多種活性生長因子直接植入衰老肌膚，激活衰老細(xì)胞的功能表達(dá)，促進(jìn)皮膚組織細(xì)胞增殖、分化和重新排列，是探索皮膚抗衰老的新方法。隨著對(duì)PRP中各類成分及其相互作用的進(jìn)一步研究和理解，這一方法在皮膚抗衰老中有著廣闊的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1]spiering AL，Pereira-smith OM，Smith JR.Correlat ion between comple mentation group for immortality anb DNA synthesis inhibitors[J].Exp Cell Res，1991，195（2）：541-545.

[2]Isobe K，Ito S，Hosaka H，et al.Nuclear-recessive mutations of fa ctorsinvolued in mit ochondrial tra nslation are responsible for age relate d respire-tion deficiency of humam skinfibroblasts[J].J Biol Chem，1998，273（8）：4601-4606.

[3]Chung JH，seo JY，Choi HB，et al.Modulation of skin collagen metabolism in aged and photoaged human skin in vivo[J].J Invest Dermatol，2001，117（5）：1218-1224.

[4]Fisher GJ，Datta SC，Tajwar HS，et al.Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism[J].Nature，1996，379（6563）：335-339.

[5]Trautinger F.Mechanisms of photodamage of the skin and its functional couseouuences forskin ageing[J].Clin Exp Dermatol，2001，26（7）：573-577.

[6]Bemeburg M，Plettenberg H，Krutmann J. Photoaging of human skin.Photodermatol Photoimmunol[J].Photomed，2000，16（6）：239-244.

[7]Giacomoni PU， Rein G.Factors of skin ageing share common mechanisms[J].Biogeron-tology，2001，2（4）：219-229.

[8]王家璧.如何延緩皮膚衰老.見朱文元，陳力.2005美容皮膚醫(yī)學(xué)新進(jìn)展[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：8-15.

[9]Weibrich G， Kleis WK，Hafner G，et al. Growth factor levels in the plateletrich plasma andcorrelations with donor age sex，and platelet count [J].J Craniomaxillofac Surg，2002，30：97-102.

[10]Robiony M，Polini F，Costa F，et al.Osteogenesis distraction and plateletrich plasma forbone restoration of the severely atrophic mandible：preliminary results[J].J Oral Maxillofac Surg，2002，60：630-635.

[11]袁霆，張長青.骨組織與軟組織修復(fù)作用中富血小板血漿制作及其原理[J].中國臨床康復(fù)，2004，8：7939-7941.

[12]Landesberg R，Roy M，Glickman RS.Quantification of growth factor levels using a simplified method of plateletrich plasma gel preparation [J].J Oral Maxillofac Surg，2000，58：297-300.

[13]Marx RE.Platelet rich plasma（PRP）： What is PRP and what is not PRP[J]？Implant Dent，2001，10：225-228.

[14]Marx RE，Carlson ER，Eichstaedt RM，et al.Plateletrich plasma： Growth factor enhancement for bone grafts [J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Raido Endod，1998，85：638-646.

[15]Sonnleitnerg D，Huemer P，Sullivan DY. A simplified technique for producing platelet-rich plasma and platelet concentraoral bone grafting techniques ： a technical note[J].Int JOral Maxillofac Implants， 2000，15：879-882.

[16]Eppley BL，Woodell JE，Higgin J.Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma：implications for wound healing [J].Plast Reconstr Eurg ，2004，114：1502-1504.

[17]Corrral C，Siddiqui A，Wu L，et al.Vascular endothelial growth factor is more important than basic fibroblastic growth factor during chemic wound healing [J].Arch Surg，1999，134：200-205.

[18]Horner A，Bord S，Kemp P，et al. Distribution of plateletderived growth factor （PDGF）A chain m RNA ，protein ，and PDGFalapha receptor in rapidly forming hunman bone [J].Bone，1996，19：353-362.

[19]Appleton L，Wound Healing： Future directions[J].Drugs，2003，6（11）：10-67.

[20]刑幫榮，利天增，卞徽寧.表皮生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)比較研究[J].中華燒傷雜志，2003，19（6）：340-343.

[21]Landesberg R，Roy M，Glickman RS.Quantification of growth factor levels using a simplified method of platetrich plasma gel preparation [J].J Oral Maxillofac Surg，2000，58：297-300.

[22]王悅，馬英智，朱著喆，等.富血小板血漿對(duì)體外培養(yǎng)條件下人真皮纖維細(xì)胞增殖能力的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，37（1）：84-88.

[23]袁霆，張長青，陸男吉，等.富血小板血漿修復(fù)皮膚缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志，2008，10（7）：651-654.

[24]Crovetti G，Martinelli G，Issi M，et al.Platelet gel for healing cutaneous chronic wounds[J].Transfus Apheresis Sci，2004，30：145-151.

[收稿日期]2012-07-24[修回日期]2012-08-21

編輯/李陽利