陳欽進(jìn) 吳強(qiáng) 倪愛(ài)平 周俊 周丹

青光眼是一種以病理性眼壓升高、視盤凹陷病理性擴(kuò)大、特征性視野損害為主要特征的致盲性眼病，具有視功能損害不可逆轉(zhuǎn)和“繼發(fā)性損害”的特點(diǎn)。青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡的方式是神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡［1］。在細(xì)胞凋亡的研究中，caspase-3受到越來(lái)越多的重視。眼壓在青光眼的病程中起著十分重要的作用，我們?cè)谘芯咳毖跽T導(dǎo)因子(hypxia-inducible factor 1α，HIF-1α)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同高眼壓及其持續(xù)時(shí)間對(duì)大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)有不同影響，故借以探討高眼壓時(shí)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 正常Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，9～10周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)。動(dòng)物使用遵守美國(guó)眼科與視覺(jué)研究協(xié)會(huì)(ARVO)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用條款。所有大鼠均在12 h明光/12 h暗光的環(huán)境中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為22～25℃，濕度為55%～60%。

1.2 大鼠急性高眼壓模型的制備和分組 采用前房灌注法制作大鼠高眼壓模型［2］。第一部分:高眼壓持續(xù)時(shí)間相同(4 h)，將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、40mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)組、60mm Hg 組、80mm Hg組、100mm Hg組，每組12只;正常對(duì)照組只進(jìn)行前房穿刺，其他各組采取前房灌注平衡鹽液的方法分別給予不同的眼壓。第二部分:眼內(nèi)壓力相同(80mm Hg)，將48只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、2 h組、4 h組、8 h組;正常對(duì)照組只進(jìn)行前房穿刺，其他各組眼內(nèi)壓持續(xù)時(shí)間各不相同。涉及眼內(nèi)的操作均遵守?zé)o菌操作規(guī)程。各組每只大鼠隨機(jī)選擇一只眼灌注，灌注過(guò)程中選擇臺(tái)式血壓計(jì)全程監(jiān)測(cè)眼內(nèi)壓［2］。

1.3 Western印跡檢測(cè) 每組取8只大鼠，提取視網(wǎng)膜總蛋白，用Lowry法進(jìn)行總蛋白質(zhì)定量，運(yùn)用Biorad垂直電泳系統(tǒng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠和5%濃縮膠);各泳道上樣總蛋白80 μg，分離膠電壓為150 V，濃縮膠電壓為100 V，在溴酚藍(lán)離開(kāi)分離膠20min后停止電泳;依據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)(7708 V，紐英倫生物技術(shù)有限公司)取含有目的蛋白和內(nèi)參蛋白的膠條;轉(zhuǎn)膜采用全濕法進(jìn)行，恒流350 mA轉(zhuǎn)移2 h;一抗?jié)舛葹?∶1000(兔抗鼠多克隆，Santa Cruz公司，美國(guó))，二抗?jié)舛染鶠?∶300(山羊抗兔多克隆，PIERCE公司，美國(guó))。同時(shí)檢測(cè)內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)(一抗1∶5000，小鼠抗大鼠單克隆，Sigma公司，美國(guó);二抗1∶300，同上)，一抗均4℃過(guò)夜，二抗置室溫?fù)u晃2 h;加ECL，攝片，通過(guò)圖像分析系統(tǒng)獲得目的蛋白和參考蛋白的表達(dá)灰度。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組處死4只大鼠，迅速摘取眼球，置入10%中性甲醛固定液中，24 h后經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(片厚約5μm)。常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù);加入一抗(抗caspase-3抗體，1∶100;Santa Cruz公司，美國(guó))后4 ℃孵育過(guò)夜;用1×TBS洗去一抗，加入二抗(1∶100，PIERCE公司，美國(guó))室溫下孵育45min;再洗去二抗，加入新鮮配制的二甲基鄰苯胺顯色液;充分水洗，終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染1min;烤干，中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察攝像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用凝膠圖像分析儀掃描照片后，用目的蛋白的表達(dá)灰度與內(nèi)參蛋白表達(dá)灰度的比值表示目的蛋白的表達(dá)相對(duì)量。所有計(jì)量資料都采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析(ANOVA)并做Dunnett-t檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼內(nèi)壓對(duì)大鼠視網(wǎng)膜caspase-3表達(dá)的影響 正常對(duì)照組、40mm Hg組、60mm Hg組、80mm Hg組和100mm Hg組的caspase-3蛋白條帶灰度與相應(yīng)βactin灰度比值分別為 1.15 ±0.04、1.16 ±0.06、1.56 ±0.05、1.73 ± 0.057、1.74 ± 0.079。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:40mm Hg組與正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.50，P=0.621);60mm Hg組、80mm Hg組和100mm Hg組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3表達(dá)顯著高于對(duì)照組(q值分別為4.87、5.28和6.71，P 值均為0.000);60mm Hg組與 80mm Hg組和100mm Hg組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為0.41和1.84，P值分別為0.687 和0.081);80mm Hg組和100mm Hg組之間大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.43，P=0.168)(圖1)。

圖1.高眼壓對(duì)caspase-3表達(dá)影響的Western印跡分析結(jié)果

2.2 高眼壓持續(xù)時(shí)間對(duì)大鼠視網(wǎng)膜caspase-3表達(dá)的影響 正常對(duì)照組、2 h組、4 h組和8 h組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3蛋白條帶灰度與相應(yīng)β-actin灰度比值分別為:1.137 ±0.09、1.139 ±0.09、1.278 ±0.11、1.319 ±0.11。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，2 h組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3表達(dá)無(wú)顯著增加(q=0.04，P=0.966)，4 h組和8 h組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組(q值分別為2.81和3.67，P值分別為0.013和0.002);4 h組和8 h組大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.86，P=0.405)(圖 2)。

2.3 實(shí)驗(yàn)各組視網(wǎng)膜caspase-3的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)各組大鼠視網(wǎng)膜可見(jiàn)部分細(xì)胞caspase-3免疫組織化學(xué)法檢查呈陽(yáng)性染色，為棕色或棕黑色著色。著色部位主要是細(xì)胞核內(nèi)，核仁未著色，著色細(xì)胞位于外叢狀層、內(nèi)叢狀層靠近內(nèi)核層區(qū)域和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，偶見(jiàn)內(nèi)叢狀層中間部位著色，但著色細(xì)胞走向?yàn)閺膬?nèi)核層向神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，內(nèi)核層、外核層及視桿視錐層沒(méi)有明顯著染。與正常對(duì)照組相比，60mm Hg組、80mm Hg組和100mm Hg組染色細(xì)胞數(shù)較多，以100mm Hg組染色最明顯;與正常對(duì)照組相比，2 h組著色無(wú)明顯增強(qiáng)，4 h組和8 h組著色明顯增強(qiáng)，但4 h組和8 h組著色無(wú)明顯差異(圖3)。

圖2.高眼壓持續(xù)時(shí)間對(duì)caspase-3表達(dá)影響的Western印跡分析結(jié)果

圖3.高眼壓及持續(xù)時(shí)間對(duì)caspase-3表達(dá)影響的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

caspase是一個(gè)半胱氨酸蛋白酶家族，具有在天冬氨酸后進(jìn)行酶切的特性，在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。目前已發(fā)現(xiàn)14種哺乳動(dòng)物的caspase，這些酶以休眠的酶原狀態(tài)存在，在特定的條件下經(jīng)過(guò)處理變?yōu)橛写呋钚缘某墒烀??；诘孜锾禺愋院图?xì)胞功能，caspase可分為3 個(gè)組，即炎癥組(caspase 1、4、5、11、12、13、14)、凋亡起始組(caspase 6、8、9、10)和凋亡效應(yīng)組(caspase 2、3、7)。細(xì)胞凋亡是復(fù)雜的caspase家族引導(dǎo)的一個(gè)蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，盡管在不同的細(xì)胞或不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘發(fā)的凋亡過(guò)程中，參與的caspase有所不同，但caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路［3-4］，也是凋亡的關(guān)鍵酶和執(zhí)行者。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜有一定caspase-3的表達(dá)，而且正常大鼠表達(dá)caspase-3的細(xì)胞定位與高眼壓大鼠表達(dá)caspase-3的細(xì)胞定位完全相同，證實(shí)正常大鼠視網(wǎng)膜也存在細(xì)胞凋亡的過(guò)程，并且高眼壓時(shí)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡與正常大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的效應(yīng)細(xì)胞在視網(wǎng)膜的位置是相同的。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，隨著眼壓一定程度的升高和高眼壓持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)進(jìn)一步增加，提示高眼壓時(shí)相關(guān)視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡活動(dòng)進(jìn)一步增強(qiáng)，可能造成更多的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和其他相關(guān)細(xì)胞的凋亡，從而引起視力損害。一些實(shí)驗(yàn)證明某些藥物可以逆轉(zhuǎn)高眼壓時(shí)大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)增加，Kamalden等［5］證實(shí)當(dāng)大鼠眼壓升高達(dá)120mm Hg時(shí)，caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)，并且這種上調(diào)可以被藥物所改善。Sun等［6］在研究中發(fā)現(xiàn)眼壓升高(130mm Hg)后，視網(wǎng)膜 caspase-3、p53和 Bcl-xl等表達(dá)上調(diào)，而原卟啉鈷可以通過(guò)促進(jìn)血紅素加氧酶的表達(dá)來(lái)阻止這些上調(diào);但是，高眼壓時(shí)caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)的機(jī)制還不是很明確。

目前，國(guó)內(nèi)外采用前房灌注生理鹽水方法來(lái)建立急性青光眼模型時(shí)，眼內(nèi)壓往往在100mm Hg以上［5-7］。我們?cè)谘芯扛哐蹓簵l件下缺氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)過(guò)程中，要求高眼壓持續(xù)時(shí)間約為4 h;同時(shí)發(fā)現(xiàn)眼壓超過(guò)80mm Hg時(shí)，HIF-1α的表達(dá)并沒(méi)有繼續(xù)增加，而本實(shí)驗(yàn)是缺氧誘導(dǎo)因子研究的一部分，研究表明在相同的灌注時(shí)間內(nèi)，前房灌注壓力為60mm Hg、80mm Hg和100mm Hg時(shí)caspase-3的表達(dá)沒(méi)有明顯差異，而在實(shí)際造模過(guò)程中眼內(nèi)壓過(guò)高時(shí)，往往造成灌注液從穿刺口液滲漏，從而導(dǎo)致眼內(nèi)壓不穩(wěn);況且，研究高眼壓大鼠視網(wǎng)膜caspase-3表達(dá)的意義在于研究人的青光眼，研究［8］表明大鼠正常的眼內(nèi)壓與人正常的眼內(nèi)壓相似，但人患青光眼時(shí)眼內(nèi)壓一般在80mm Hg以下;再有，過(guò)高的眼內(nèi)壓可能造成視網(wǎng)膜壞死而不是凋亡，所以在采用前房灌注方法建立大鼠高眼壓模型研究 caspase-3時(shí)，建議眼內(nèi)壓保持在80mm Hg為宜。本研究表明眼內(nèi)壓為80mm Hg，高眼壓持續(xù)時(shí)間為2 h時(shí)caspase-3的表達(dá)無(wú)明顯上調(diào)，高眼壓持續(xù)時(shí)間為4 h時(shí)caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)，增加高眼壓持續(xù)時(shí)間，caspase-3表達(dá)的進(jìn)一步上調(diào)不明顯，而增加高眼壓持續(xù)時(shí)間可能會(huì)增加大鼠的死亡、眼內(nèi)壓不穩(wěn)等風(fēng)險(xiǎn)，提示研究高眼壓大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)時(shí)，高眼壓持續(xù)時(shí)間選定4 h較為適合。所以，采用前房灌注平衡鹽液制作急性青光眼模型研究高眼壓大鼠視網(wǎng)膜caspase-3的表達(dá)時(shí)，眼內(nèi)壓為80mm Hg、高眼壓持續(xù)時(shí)間為4 h較為適合。

［1］Quigly HA，Nickells RW，Kerrigan LA，et al.Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1995，36(5):774-786.

［2］陳欽進(jìn)，管懷進(jìn)，解正高，等.臺(tái)式血壓計(jì)監(jiān)測(cè)大鼠急性高眼壓模型建立過(guò)程中的眼內(nèi)壓［J］.中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2007，7(4):211-213.

［3］Cohen GM.Caspase:the executioners of apoptosis［J］.Bio Chem，1997，326(1):1-16.

［4］Patel T，Gores GJ，Kaufmann SH.The role of protease during apoptosis［J］.FASEB，1996，10(5):587-597.

［5］Kamalden TA，Ji D，F(xiàn)awcett RL，et al.Genistein blunts the negative effect of ischeamia to the retina caused by an elevation of intraocular pressure［J］.Ophthalmic Res，2011，45(2):65-72.

［6］Sun MH，Pang JH，Chen SL，et al.Retinal protection from acute glaucoma-induced ischemia-refusion injury though pharmacologic induction of Heme Oxygenase-1［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(9):4798-808.

［7］陳芝清，姚克，徐雯，等.E-64d對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中Calpain和caspase-3表達(dá)的調(diào)控作用［J］.眼科研究，2007，25(1):44-48.

［8］馬建洲，謝琳，賀翔鴿，等.正常大鼠麻醉狀態(tài)下的眼壓分布規(guī)律［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9(2):115-117.