曹慧霞，牛福坤，尤冠巧，閻 磊，朱 清，邵鳳民

河南省人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕免疫科鄭州450003

腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎功能衰竭的共同途徑，而腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)則是纖維化發(fā)生與進(jìn)展的重要機(jī)制之一。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-beta 1，TGF-β1)是公認(rèn)的EMT 調(diào)節(jié)因子［1］，參與啟動(dòng)和完成體內(nèi)整個(gè)EMT過(guò)程，同時(shí)它也能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化。硫化氫(H2S)是近年繼CO、NO之后發(fā)現(xiàn)的第三種內(nèi)源性氣體分子，具有較強(qiáng)的抗炎癥、抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡等生理功能［2］。已有研究［3］發(fā)現(xiàn)，血清 H2S可能在慢性腎臟病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。H2S可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程，也可以抑制胰腺星狀細(xì)胞的EMT［4-5］。而有關(guān)H2S是否可以抑制腎小管上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程還不清楚。該研究旨在探討H2S對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞HK-2轉(zhuǎn)分化的影響，并探討其可能機(jī)制，為臨床針對(duì)腎臟纖維化的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細(xì)胞系(ATCC公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，TGF-β1(Peprotech 公司)，2.5 g/L 胰蛋白酶(Genview公司)，谷氨酰胺和DMSO(Amresco公司)，青霉素及鏈霉素(華北制藥廠)，小鼠抗人E-cadherin及小鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體、NaHS(Sigma公司)，兔抗人磷酸化Smad 2/3(p-Smad2/3)多克隆抗體、小鼠抗人Smad2單克隆抗體(Santa Cruz公司)，HRP標(biāo)記大鼠抗小鼠標(biāo)記IgG、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞復(fù)蘇后，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)傳代細(xì)胞長(zhǎng)至70% ～80%融合，用無(wú)血清培養(yǎng)液靜止24 h進(jìn)行同步化處理后，用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分4組。正常對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng);NaHS組:選用NaHS作為H2S供體，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用 100 μmol/L NaHS 干預(yù);TGF-β1 組:用 10 μg/L TGF-β1 干預(yù);NaHS+TGF-β1 組:用 TGF-β1(10 μg/L)與 NaHS(100 μmol/L)共同干預(yù)。分別于培養(yǎng) 0、15、30和60 min后，收集各組細(xì)胞，進(jìn)行p-Smad2/3和Smad2蛋白檢測(cè);培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和α-SMA及E-cadherin蛋白檢測(cè)。

1.4 目標(biāo)蛋白的Western blot檢測(cè) 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)棄培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4℃ 1 000 g離心20 min，留取上清。Bradford法測(cè)定蛋白濃度。待測(cè)樣品按80 μg/孔上樣，行100 g/L SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。50 g/L脫脂奶粉于37℃封閉1 h，加小鼠抗人α-SMA、E-cadherin單克隆抗體(按200倍稀釋)或兔抗人p-Smad2/3多克隆抗體、小鼠抗人Smad2單克隆抗體(按1 000倍稀釋)4℃孵育過(guò)夜，加HRP標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG(按5 000倍稀釋)37℃孵育1 h，ECL顯影成像。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Quantity One系統(tǒng)對(duì)特異性條帶進(jìn)行吸光度測(cè)定，以目標(biāo)蛋白與GAPDH條帶吸光度的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。以(p-Smad2/3)/Smad2相對(duì)表達(dá)量的比值表示Smad2/3磷酸化水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。4組細(xì)胞α-SMA和E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量以及同一時(shí)間點(diǎn)(p-Smad2/3)/Smad2的比較采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn) 4組細(xì)胞孵育48 h后的形態(tài)見(jiàn)圖1。正常對(duì)照組細(xì)胞多呈圓形或卵圓形，偶有細(xì)胞呈輕度多角形變;NaHS組細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照組相似;TGF-β1組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，大多數(shù)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間隙明顯增寬，類似肌成纖維細(xì)胞;NaHS+TGF-β1組細(xì)胞發(fā)生梭形變的程度較TGF-β1組明顯減輕。

2.2 4組細(xì)胞α-SMA和E-cadherin蛋白的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2、表1和2。

2.34 組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(p-Smad2/3)/Smad2的比較 結(jié)果見(jiàn)圖3、表3。

圖1 4組細(xì)胞的形態(tài)(倒置顯微鏡，×200)

圖2 4組細(xì)胞E-cadherin和α-SMA蛋白的表達(dá)

表1 4組細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的比較(n=3)

表2 4組細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的比較(n=3)

圖3 4組細(xì)胞p-Smad2/3和Smad2蛋白的表達(dá)

表3 4組細(xì)胞(p-Smad2/3)/Smad2比值的比較(n=3)

3 討論

腎小管EMT作為腎小管間質(zhì)纖維化的重要機(jī)制之一，近年來(lái)一直備受關(guān)注。2002年，Iwano等［6］的研究顯示，在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中約36%腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞來(lái)源于EMT，而這些轉(zhuǎn)分化來(lái)源的成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力。Liu等［7］將EMT的主要過(guò)程歸結(jié)為4步:①失去上皮細(xì)胞特征，失去上皮間緊密連接，如E-cadherin的表達(dá)受抑。②表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞特征分子，肌動(dòng)蛋白重排。③腎小管基底膜破壞。④細(xì)胞移動(dòng)性和侵襲性增強(qiáng)。而TGF-β1則被認(rèn)為是惟一的必須參與啟動(dòng)和完成整個(gè)EMT過(guò)程的細(xì)胞因子［8］。該研究結(jié)果顯示，應(yīng)用 10 μg/L TGF-β1 刺激 HK-2 細(xì)胞48 h，HK-2細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化，而轉(zhuǎn)分化后的細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)下降，α-SMA蛋白表達(dá)升高，證實(shí)TGF-β1在腎小管上皮細(xì)胞EMT中發(fā)揮了重要作用。

H2S之前一直作為有毒氣體被大家所認(rèn)識(shí)，近些年人們才發(fā)現(xiàn)H2S還是一種具有生理/病理生理功能的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。已有的研究顯示，H2S在體內(nèi)心血管、神經(jīng)、消化、呼吸等多個(gè)系統(tǒng)均發(fā)揮著重要的生物學(xué)效應(yīng)，其在腎臟中的作用也正受到越來(lái)越多的重視。Xia等［9］的研究結(jié)果顯示，腎組織自身可表達(dá)胱硫醚γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚合成酶(CBS)等主要的H2S合成酶，用以獨(dú)立合成內(nèi)源性H2S;而內(nèi)源性H2S不僅可以通過(guò)調(diào)節(jié)腎血管和腎小管活性來(lái)參與腎功能的調(diào)控，也可通過(guò)維持腎小球結(jié)構(gòu)完整性、感受腎實(shí)質(zhì)氧分壓的變化等途徑調(diào)控腎功能。Perna等［10］發(fā)現(xiàn)，血液透析患者血漿H2S濃度顯著降低，體內(nèi)CBS等表達(dá)減少，而血中H2S濃度的減少可能是血液透析患者心血管并發(fā)癥形成的重要原因之一。Aminzadeh等［11］在大鼠5/6腎切除模型中同樣發(fā)現(xiàn)H2S濃度和H2S合成酶表達(dá)的下降，而體內(nèi)相關(guān)氧化應(yīng)激產(chǎn)物則顯著增加，推測(cè)H2S對(duì)慢性腎臟病的影響與其抗氧化應(yīng)激的作用有關(guān)。陳燊等的系列研究［12-13］結(jié)果顯示，補(bǔ)充外源性H2S有可能通過(guò)抑制糖尿病腎病模型大鼠腎臟中成肌纖維細(xì)胞的生成，減輕細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積聚，從而有效地抑制糖尿病腎病的病理改變。

雖然到目前為止有關(guān)H2S與EMT或臟器纖維化的關(guān)系研究相對(duì)較少，但已有的報(bào)道［4-5］結(jié)果均提示H2S可延緩EMT或臟器纖維化進(jìn)程。該研究以體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞為研究對(duì)象，以NaHS作為H2S供體，觀察 H2S對(duì) TGF-β1誘導(dǎo)的 HK-2細(xì)胞EMT的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn) NaHS+TGF-β1組細(xì)胞較TGF-β1組細(xì)胞 E-cadherin蛋白表達(dá)顯著升高，α-SMA蛋白表達(dá)則明顯下降，同時(shí)也部分保留了上皮細(xì)胞的形態(tài)特征，表明H2S對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人腎小管EMT有抑制作用。

TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路目前被認(rèn)為是惟一介導(dǎo)TGF-β1胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路，而p-Smad2/3是TGF-β1/Smad信號(hào)通路中的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其蛋白表達(dá)量則是TGF-β1/Smad信號(hào)通路激活程度的標(biāo)志。作者分別觀察了TGF-β1組和NaHS組HK-2細(xì)胞中p-Smad2/3表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)TGF-β1組p-Smad2/3水平較正常對(duì)照顯著增高，NaHS+TGF-β1組卻較 TGF-β1組顯著下降，這與 Fang等［4］在肺泡上皮細(xì)胞中的研究結(jié)果一致。提示H2S可能通過(guò)抑制Smad2/3磷酸化來(lái)干擾TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的進(jìn)程，但其具體的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，該研究證實(shí)H2S可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2轉(zhuǎn)分化進(jìn)程，而該作用可能在一定程度上通過(guò)影響Smad2/3磷酸化水平來(lái)完成。

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