韓耀玲，徐騰飛，賈中祥，楊春鵬，劉 洋，史順?biāo)?，韓 光

（河南大學(xué)藥學(xué)院 天然藥物化學(xué)教研室，河南 開封 475004）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）為多孔菌科的藥用真菌，在我國的黑龍江、吉林兩省資源較為豐富，民間廣泛用于治療一些惡性腫瘤［1］。對于樺褐孔菌的化學(xué)成分及生物活性研究已證實(shí)其具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂及保肝等廣泛的藥理作用［2-13］。已有的報(bào)道多集中于羊毛脂烷型四環(huán)三萜類等小分子次生代謝產(chǎn)物的分離及相應(yīng)的生物活性研究，并取得顯著的研究成果，發(fā)現(xiàn)不少活性化合物。樺褐孔菌原藥材中總?cè)疲ù继嵛铮┘s占4.5%，較之多糖（最高可達(dá)14.1%）而言尚為少量［14］，而含量頗豐的多糖在樺褐孔菌的藥效發(fā)揮中是否具有重要作用也是意義重大的研究，故近年陸續(xù)出現(xiàn)了樺褐孔菌粗多糖抗氧化、抗腫瘤、降血脂等藥理作用的相關(guān)報(bào)道［15-17］。

對于粗多糖的提取多為傳統(tǒng)的水提醇沉法，所得多糖產(chǎn)物中多含蛋白質(zhì)、色素、無機(jī)離子等雜質(zhì)，而其中蛋白質(zhì)對于多糖的結(jié)構(gòu)和活性研究的干擾是最大的，故對粗多糖的除蛋白效果就顯得尤為重要，在此前提下，我們以多糖保留率和蛋白去除率為雙重指標(biāo)，對Sevag法、三氯乙酸法和酶法等常用的除蛋白方法進(jìn)行了研究評價(jià)。

1 儀器與試劑

RE52－05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；UV－1600型分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；電子天平（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；胃蛋白酶（1∶10000）；考馬斯亮藍(lán)為生化試劑；硫酸、蒽酮、氯仿、正丁醇和三氯乙酸均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 粗多糖的提取

取樺褐孔菌干燥子實(shí)體1kg，粉碎，體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇回流提取3次，1h／次，取藥渣，加10倍量的水，沸水提取3次，提取時間分別為60、40、30min，將提取液合并后減壓濃縮至2L，緩緩加入無水乙醇至含醇量為75%，靜置過夜，抽濾，并將沉淀依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌，真空干燥10h，得樺褐孔菌粗多糖81g；將粗多糖配制成體積分?jǐn)?shù)1%的水溶液，并依次用Sevag法、三氯乙酸法和酶法進(jìn)行除蛋白處理，并對其精制效果進(jìn)行比較和評價(jià)。

2.2 粗多糖的精制（除蛋白）

Sevag法：將氯仿與正丁醇4∶1混合，配成Sevag試劑，加入多糖水溶液（多糖水溶液／Sevag試劑為4∶1），劇烈振搖20min，2000r／min離心10min，分取水層（上層）；將水層如此反復(fù)除蛋白6次，即得Sevag法除蛋白的多糖水溶液。

三氯乙酸法：將三氯乙酸加水配制成0.5mol／L，加入多糖水溶液（多糖水溶液／三氯乙酸溶液為20∶3），劇烈振搖20min，靜置40min，2000r／min離心10min，取上清液即得三氯乙酸法除蛋白的多糖水溶液。

酶法：將胃蛋白酶加入多糖水溶液，加入量為1∶200（mL∶U），30℃水浴，酶解2h，沸水浴5min，對酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫，2000r／min離心10min，取上清液即得酶法除蛋白的多糖水溶液。

2.3 測定多糖與蛋白的含量

測定溶液的配制：精密稱取蒽酮100mg，溶解于體積分?jǐn)?shù)80%硫酸溶液100mL中，配制成硫酸－蒽酮溶液；精密稱取考馬斯亮藍(lán)G－250100mg，分別加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇50mL和體積分?jǐn)?shù)85%磷酸100mL溶解，最后用蒸餾水定容至1000mL，配制成考馬斯亮藍(lán)溶液。

硫酸－蒽酮法測定多糖：取粗多糖水溶液和除蛋白的多糖水溶液加10倍量的水進(jìn)行稀釋，取2mL，加入硫酸－蒽酮溶液6mL，混勻，沸水浴15min，冰浴15min，于625nm處測定其吸光度。

考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白：取粗多糖水溶液和除蛋白的多糖水溶液加10倍量的水進(jìn)行稀釋，取1mL，加入考馬斯亮藍(lán)溶液5mL，混勻，放置10min，于595nm處測定其吸光度。

3 結(jié)果與討論

按照“2.3”操作方法分別將Sevag法、三氯乙酸法和酶法除蛋白后的多糖水溶液進(jìn)行多糖與蛋白的含量測定，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次。測定結(jié)果表明，Sevag法的多糖保留率較高（72.9%），多糖損失較小，但蛋白去除率最低（9.5%），對粗多糖的精制效果不佳；三氯乙酸法一次性可除去96.0%的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，精制效果較好，但多糖保留率僅為13.3%，損失嚴(yán)重；酶法的多糖保留率為46.9%，蛋白去除率為43.8%，見表1、圖1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對于樺褐孔菌多糖而言，Sevag法、三氯乙酸法和酶法均不能同時保持較高的多糖保留率和蛋白去除率，故均不是最佳的除蛋白方法。經(jīng)綜合分析，Sevag法的多糖保留率較高，多糖損失較小，而三氯乙酸法則具有最高的蛋白去除率，故在實(shí)際操作中可考慮將Sevag法和三氯乙酸法結(jié)合起來應(yīng)用，以同時保持較高的多糖保留率和蛋白去除率，達(dá)到較好的精制效果。

表1 Sevag法、三氯乙酸法和酶法的除蛋白結(jié)果比較

圖1 粗多糖溶液與3種方法除蛋白后水溶液多糖和蛋白測定結(jié)果圖

有文獻(xiàn)［18］報(bào)道，樺褐孔菌胞外多糖最佳的脫蛋白工藝為三氯乙酸法，其蛋白質(zhì)去除率為68.5%，多糖損失率僅為2.45%。樺褐孔菌胞外多糖乃菌絲體培養(yǎng)液中存在的多糖，而培養(yǎng)液又為水溶液，與樺褐孔菌細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境有所不同，可能會使其多糖結(jié)構(gòu)有所相同。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的樺褐孔菌胞外多糖的脫蛋白工藝結(jié)果不符，也進(jìn)一步說明樺褐孔菌多糖與人工培養(yǎng)的菌絲體胞外多糖的結(jié)構(gòu)中載蛋白情況可能不同，其藥理作用也可能不盡相同（因結(jié)構(gòu)決定活性），而這些均有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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