唐海洋 譚利明

【摘要】目的：觀察阿托伐他汀對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE）Wistar大鼠的發(fā)病情況、組織病理變化及腦組織內(nèi)T細(xì)胞免疫球蛋白和黏液域蛋白-3（TIM-3）、T細(xì)胞免疫球蛋白和黏液域蛋白-1（TIM-1）表達(dá)水平的影響。方法：將30只雌性Wistar大鼠隨機分為佐劑組、EAE組、阿托伐他汀組，以豚鼠脊髓勻漿（GPSCH）誘發(fā)制備大鼠EAE模型，并于給予GPSCH當(dāng)日開始1次/d灌服0.1%PBS溶液1.5ml/只（佐劑組和EAE組）和含阿托伐他汀的0.1%PBS溶液，1次/d，劑量為8mg/（kg·d），連續(xù)13d，觀察EAE癥狀并評分，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測Tim-1mRNA、Tim-3mRNA在腦組織中的表達(dá)。結(jié)果：阿托伐他汀組發(fā)病率降低、臨床癥狀減輕，體重下降減少（P<0.05）；與佐劑組比較，EAE組TIM-3mRNA明顯上升（P<0.05），阿托伐他汀組TIM-3mRNA較EAE組明顯下降（P<0.05）；與佐劑組比較，EAE組TIM-1mRNA下降（P<0.05），阿托伐他汀組TIM-1mRNA較EAE組上升（P<0.05）。結(jié)論：EAE大鼠TIM-3上升，TIM-1下降，提示其在EAE發(fā)病機制中發(fā)揮作用，通過下調(diào)TIM-3、上調(diào)TIM-1的表達(dá)，可能是阿托伐他汀對EAE保護(hù)作用機制之一。

【關(guān)鍵詞】實驗性自身免疫性腦脊髓炎；多發(fā)性硬化；TIM-3；TIM-1；阿托伐他汀

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘為特征的疾病，是研究MS的理想動物模型[1]。T細(xì)胞免疫球蛋白和黏液域蛋白（TIM）家族是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白，可以作為Th細(xì)胞的分化標(biāo)志[2]。TIM-3是TIM家族中的一員，Monney等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)運用TIM-3特異性抗體使EAE小鼠疾病死亡率增加，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥病灶增多，增加和激活CD11b+細(xì)胞。TIM-1最先被發(fā)現(xiàn)與變應(yīng)性哮喘的發(fā)生有關(guān)[4]。TIM-1選擇性表達(dá)于Th2細(xì)胞上，在Th1細(xì)胞及Th17細(xì)胞上沒有表達(dá)[5]。目前研究提示，在人體中，TIM-1不僅與過敏性疾病和哮喘有關(guān)，在自身免疫性疾病中也起著調(diào)節(jié)作用，如在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生與TIM-1的外顯子4相關(guān)，C反應(yīng)蛋白與類風(fēng)濕因子的水平與TIM-1基因的啟動子多態(tài)性相關(guān)[6]。在MS緩解期患者腦脊液單核細(xì)胞上可檢測到TIM-1mRNA的表達(dá)，提示TIM-1對MS的恢復(fù)具有有益作用，其機制可能與免疫耐受有關(guān)[7]。

目前各種能夠緩解EAE病情的免疫調(diào)節(jié)藥物在MS的治療作用仍在試驗階段，且存在相關(guān)的副作用及潛在的毒性作用[8]。最近發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除了其調(diào)脂作用外，亦存在免疫調(diào)節(jié)作用使之用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，如MS的研究越來越多[9]。他汀類藥物運用于MS以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等得臨床試驗也已經(jīng)得到有前景的結(jié)果[10]。他汀類藥物的免疫調(diào)節(jié)作用包括有保護(hù)血腦屏障的完整性[11]，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞浸潤[11]，促進(jìn)Th1細(xì)胞反應(yīng)向Th2細(xì)胞反應(yīng)偏移等[9]。最近發(fā)現(xiàn)除外其免疫調(diào)節(jié)作用外，他汀類藥物對EAE還具有神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生的作用[12]。

本實驗從免疫誘導(dǎo)第1天開始予以阿托伐他汀藥物治療，根據(jù)國外文獻(xiàn)報道，選擇8mg/（kg·d）作用治療劑量，觀察阿托伐他汀對EAE的治療作用。并通過檢測TIM-3及TIM-1mRNA的表達(dá)情況檢測阿托伐他汀是否通過影響其表達(dá)對EAE起治療作用。

1材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠30只，6～8周齡，體重（200±20）g，雌性；豚鼠10只，300～400g，雌雄不限。購于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院實驗動物養(yǎng)殖場。在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動物實驗中心分籠飼養(yǎng)，每籠5只。喂食本醫(yī)院動物實驗中心配置的大鼠飼料，飲自來水，保持室溫（18±2）℃，相對濕度（50±10）％，人工光照時間12h/d，自動抽風(fēng)，每日上午更換食、水和墊料1次，飼養(yǎng)觀察3d，能正常進(jìn)食和飲水者納入實驗用鼠。

1.2主要試劑阿托伐他汀購自大連輝瑞制藥有限公司，卡介苗（BCG）凍干粉購自北京生物制品研究所，醫(yī)用羊毛脂購自重慶化學(xué)試劑廠，羅可沙爾堅牢藍(lán)購自Sigma公司，RT-PCR試劑盒由Fermentas公司生產(chǎn)，EDTA、Tris購自Sigma公司，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3抗原制備完全福氏佐劑（CFA）的配制：取醫(yī)用的石蠟油40ml，醫(yī)用羊毛脂10g，于三角瓶內(nèi)充分混合，高溫滅菌30min，制成不完全福氏佐劑。將失活的卡介苗凍干粉60mg用少量生理鹽水溶解加入不完全福氏佐劑中充分混合均勻，制成含卡介苗為6mg/ml的完全福氏佐劑，置于4℃冰箱保存。豚鼠脊髓勻漿（guineapigspinalcordhomogenate，GPSCH）提取和免疫抗原制作：用10％水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉豚鼠處死后，剝出脊髓，去掉馬尾與脊膜并稱重，加入少量無菌冰生理鹽水，用手動勻漿器將其制成50％（質(zhì)量濃度）的豚鼠脊髓勻漿。取等體積的GPSCH與CFA混勻制成穩(wěn)定的油包水型乳劑，置于4℃的冰箱保存并于12h內(nèi)用于誘發(fā)EAE。

1.4實驗動物分組及干預(yù)處理將30只雌性Wistar大鼠隨機分為三組：佐劑組（CFA）（n=10），用生理鹽水代替免疫抗原，常規(guī)飼養(yǎng)，即日開始灌服0.1%PBS溶液，每次灌服液體量1.5ml/只，1次/d；EAE組（n=10），無菌操作下，在Wistar大鼠雙后肢足墊皮下注射GPSCH-CFA乳劑（0.2ml/100g），EAE模型建立后，常規(guī)飼養(yǎng)，即日開始灌服0.1%PBS溶液，每次灌服液體量1.5ml/只，1/d次。阿托伐他汀組（n=10），EAE模型建立后常規(guī)飼養(yǎng)，即日開始灌服含阿托伐他汀的0.1%PBS溶液，1次/d，劑量為8mg/（kg·d）。

1.5動物行為觀察和神經(jīng)功能障礙評分將免疫抗原注射日定為第0天，每日稱體重觀察病情并進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評分。從出現(xiàn)臨床癥狀開始至實驗終止每天按照Benson評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分（如下），2次/d。1級：尾部無力或跋踞步態(tài)伴尾部有力；2級：蹣跚步態(tài)伴尾部無力（共濟失調(diào)）；2.5級：共濟失調(diào)伴部分單肢麻痹；3級：單肢完全麻痹；3.5級：單肢完全麻痹伴另一肢體部分麻痹；4級：雙肢完全麻痹；4.5級；四肢麻痹；5級：死亡。

1.6動物處死時間和標(biāo)本處理于大鼠免疫后第13天（相當(dāng)于EAE組發(fā)病高峰期）終止實驗，處死所有大鼠，無菌條件下迅速取出完整腦，留左腦后放入RNase-free的凍存管于液氮環(huán)境下保存，以作為提取RNA用。右腦標(biāo)本放入4%多聚甲醛固定，進(jìn)行HE染色和LFB染色。

1.7RT-PCR法檢測Tim-3mRNA、Tim-1mRNA表達(dá)取保存液氮中的腦組織采取Trizol法提取各樣本總RNA，紫外分光光度計測定濃度并定量后逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)GenBank中目的基因所對應(yīng)的cDNA表達(dá)序列和提供的相關(guān)資料，利用軟件PrimerPremier5.0設(shè)計上下游引物：TIM-3：上游引物：5′-CAATTCCCTGGCCCAATGAATGA-3′，下游引物：5′-ACTTCCCTCAGTGGTTAGGGTTCT-3′Tm60℃，產(chǎn)物長度為150bp。TIM-1：上游引物5′-TGGTTGTCACCAGGTACATCA

TTATA-3′，下游引物：5′-TGCGTTCTGCAAAGCTCTACTC-3′Tm56℃，產(chǎn)物長度為170bp。GAPDH：上游引物：5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3′，下游引物：5′-GTCTCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′Tm58℃，產(chǎn)物長度為450bp。PCR反應(yīng)條件見表1。

通過PCR最后確定TIM-3、TIM-1退火溫度（Tm）分別為60℃、56℃，最后按照此條件進(jìn)行所有樣品的PCR擴展。產(chǎn)物于1%瓊脂凝膠電泳；凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.8數(shù)據(jù)分析將圖片采集，并用Qualityone軟件對圖像進(jìn)行灰度分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理所有統(tǒng)計分析均用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包完成，計量資料以（x±s）表示，多組計量資料均數(shù)比較用單因素完全隨機方差分析（ANOVA），并做多組間兩兩均數(shù)比較（LSD-t檢驗法）。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1實驗大鼠的發(fā)病率、體重及神經(jīng)功能評分變化佐劑組無大鼠發(fā)病。EAE組共有8只大鼠發(fā)病，發(fā)病率為80%，有1只大鼠死亡。阿托伐他汀組共有3只大鼠發(fā)病，發(fā)病率為30%。佐劑組大鼠體重逐步增加。EAE組各亞組大鼠的體重?fù)p失隨病情加重而增加，在發(fā)病高峰時體重?fù)p失達(dá)到最高值。阿托伐他汀組大鼠體重?fù)p失較EAE組減少，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。佐劑組神經(jīng)功能評分0。EAE組神經(jīng)功能評分高于阿托伐他汀組（P<0.05）。見表2。

2.2實驗大鼠腦組織的病理學(xué)變化佐劑組大鼠CNSHE染色結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤（圖3）。EAE組大鼠腦實質(zhì)內(nèi)可見血管“袖套”樣改變，亦可見膠質(zhì)細(xì)胞及一定數(shù)量的巨噬細(xì)胞（圖4）。阿托伐他汀組大鼠腦組織炎性細(xì)胞浸潤的程度較EAE組減少（圖5）。LFB染色EAE組可見大片或融合的脫髓鞘灶，甚至軸索染色亦缺失，呈空泡樣改變（圖2）。阿托伐他汀組未見明顯髓鞘脫失。

圖5阿托伐他汀組大鼠側(cè)腦室周圍組織未見炎性細(xì)胞浸潤×400

2.3RT-PCR結(jié)果與佐劑組比較，EAE組TIM-3mRNA上升（P<0.05），阿托伐他汀組TIM-3mRNA較EAE組下降（P<0.05）。與佐劑組比較，EAE組TIM-1mRNA下降（P<0.05），阿托伐他汀組TIM-1mRNA較EAE組上升（P<0.05）。見表3。

3討論

以往EAE被認(rèn)為是針對自身髓鞘的Th1型反應(yīng)為主的自身免疫性疾病。近年來越來越多的證據(jù)提示，Th17細(xì)胞亦參與該疾病的病理過程。最初認(rèn)為，CD4+效應(yīng)T細(xì)胞分為Th1和Th2細(xì)胞兩類。Th1/Th2平衡在EAE的發(fā)病機制中起著重要的作用。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，Th1/Th2平衡的偏移導(dǎo)致Th1細(xì)胞增多是造成MS發(fā)病的關(guān)鍵。TIM家族是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白，因為其在T細(xì)胞上表達(dá)情況的不同可以作為Th細(xì)胞的分化標(biāo)志。TIM-3被發(fā)現(xiàn)特異性的表達(dá)于Th1細(xì)胞上，而在Th2細(xì)胞上無表達(dá)。TIM-1選擇性表達(dá)與Th2細(xì)胞上，在Th1細(xì)胞及Th17細(xì)胞上沒有表達(dá)。在MS緩解期患者腦脊液單核細(xì)胞上可檢測到TIM-1mRNA的表達(dá)，提示TIM-1對MS的恢復(fù)具有有益作用，其機制可能與免疫耐受有關(guān)。綜上所述，TIM-3可作為Th1細(xì)胞的分化標(biāo)志，而TIM-1可作為Th2細(xì)胞的分化標(biāo)志。本實驗通過檢測上述兩個指標(biāo)間接反應(yīng)EAE大鼠中Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞的變化。在EAE大鼠中TIM-3mRNA上升，TIM-1mRNA下降，符合EAE發(fā)病過程中Th1型反應(yīng)增多，同時Th2型反應(yīng)有所下降，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。

目前大量研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物在體內(nèi)抑制膽固醇生物合成同時，還具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用，對某些神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病如MS，EAE等有治療作用。本實驗中筆者使用阿托伐他汀干預(yù)EAE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后的EAE大鼠發(fā)病率、神經(jīng)功能損傷評分、體重變化等較佐劑組和EAE組大鼠明顯減輕或延遲，病理方面炎性細(xì)胞浸潤及脫髓鞘病變亦較EAE組明顯減少。以上結(jié)果均證實阿托伐他汀對EAE大鼠的治療作用。HE染色顯示炎性細(xì)胞明顯減少，推測其與抑制抑制T淋巴細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移，保護(hù)BBB完整性，從而減少CNS系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤有關(guān)。LFB染色結(jié)果脫髓鞘病變少見，證實了阿托伐他汀的神經(jīng)保護(hù)作用，推測其機制可能與抑制促炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞毒素釋放，增強少突膠質(zhì)干細(xì)胞的存活和分化，抑制反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)增生，形成有利于髓鞘再生的環(huán)境。本實驗還通過測定TIM-3及TIM-1mRNA發(fā)現(xiàn)，與EAE比較阿托伐他汀干預(yù)后TIM-3表達(dá)下降，TIM-1表達(dá)上升，提示其能通過減少Th1型反應(yīng)減少EAE中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，并使之向Th2型反應(yīng)轉(zhuǎn)化，從而使EAE病情緩解，對EAE產(chǎn)生治療作用。

綜上所述，阿托伐他汀可能是一種有前景的多發(fā)性硬化治療藥物。

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（收稿日期：2012-11-14）（本文編輯：王宇）