朱恒梅 祝勝郎 陳結(jié)慧 葉 玲 蔣 瑩 李向陽

廣東省深圳市第六人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 深圳 510082

高血糖作為糖尿病的最基本生化特性,通過多種機(jī)制引起糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN），其中氧化應(yīng)激是一個重要損傷機(jī)制。而有研究發(fā)現(xiàn)高血糖介導(dǎo)的ROS可以激活多聚 ADP 核糖聚合酶 [poly （ADP-ribose）polymerase，PARP][1]。PARP是一種存在于除酵母外所有真核細(xì)胞核內(nèi)對DNA斷裂敏感的蛋白酶，目前其在DN發(fā)病機(jī)制中的作用尚未完全闡明。DN時，腎小球系膜細(xì)胞是多種致病因子作用的主要靶細(xì)胞，主要表現(xiàn)為腎小球的肥大、細(xì)胞外基質(zhì)的堆積、腎小球基底膜的增厚和腎小球濾過屏障功能的異常，其中腎臟細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的蓄積引起的腎小球硬化與間質(zhì)纖維化是DN發(fā)展至終末期腎功能衰竭的主要病理表現(xiàn)[2]。因此本實(shí)驗以大鼠腎臟系膜細(xì)胞作為研究對象，探討多聚二磷酸腺苷（ADP）核糖聚合酶-1（PARP-1）在高糖致外細(xì)胞基質(zhì)沉積中的作用，以探討PARP在DN發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

D-Glucose購自Sigma公司，PJ34購自默克公司；細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640，胎牛血清購自Gibco公司；Trizol溶液購自美國Invitrogen公司；胰島素購自甘李藥物公司，Trizol Reagent購自Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液、HRP標(biāo)記的兔抗大鼠Ⅱ抗、小鼠抗大鼠Ⅱ抗購自Cell signaling公司，小鼠抗大鼠COLⅣ、FN一抗，兔抗大鼠PARP-1一抗購自CHEMICON公司；PARP/Apoptosis檢測試劑盒購自trevigen公司；RevertAidTM FirstStrand cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，Taq DNA聚合酶購自Takaka公司。其余化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 大鼠腎臟系膜細(xì)胞株 （MCs 1097，購自美國ATCC公司）培養(yǎng)于含有15%胎牛血清及0.6 U/mL胰島素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)至85%融合后，換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，后換用新鮮無血清的DMEM低糖（5 mmol/L）培養(yǎng)基，分別加入藥物刺激干預(yù)：高糖刺激組中高糖濃度為25 mmol/L，刺激時間為24 h。PJ34干預(yù)組先給予3×10-6mol/L PJ34孵育1 h后，加入高糖刺激24 h。單純使用PJ34組作為對照。

1.2.2 細(xì)胞總蛋白提取 細(xì)胞用PBS清洗后加入細(xì)胞裂解液，冰上放置5 min。用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，收集至1.5 mL Eppendorf管中，放置于冰上。用超聲粉碎儀在冰上進(jìn)行超聲粉碎，500 W、1 s×15次，以剪切 DNA，降低黏稠度。4℃，12000 r/min離心10 min，留取上清。取10 μL上清測定濃度，余儲存于-80℃?zhèn)溆?。?xì)胞總蛋白提取物做Western blot分析高糖對于大鼠腎臟系膜細(xì)胞PARP-1表達(dá)的影響。

1.2.3 RT-PCR大鼠腎臟系膜細(xì)胞總RNA的提取按照Trizol說明書操作。RT-PCR引物購自美國INVITROGEN公司上海分部。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及RT-PCR反應(yīng)：取1.0 μg的總RNA采用 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，以 Oligo（dT）18為引物合成第一鏈cDNA（按試劑盒說明書進(jìn)行）；②PCR：采用Takaka公司試劑盒 PCR反應(yīng)擴(kuò)增。引物序列見表1。產(chǎn)物儲存于-20℃。取8 μL PCR產(chǎn)物在含有0.5 μg/mL溴化乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖凝膠中以85 V恒壓電泳30 min，紫外檢測儀上觀察，用凝膠圖像成像系統(tǒng)成像及進(jìn)行掃描定量分析DNA帶的含量，以所測得積分吸光度與內(nèi)參照β-actin積分吸光度的比值代表半定量值。PARP-1、COLⅣ、FN、β-actin引物序列及反應(yīng)條件見表1。

1.2.4 PARP活性檢測 細(xì)胞 PARP活性檢測按照 PARP/Apoptosis檢測試劑盒（trevigen公司）說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組數(shù)據(jù)之間差異顯著性用多個樣本均數(shù)比較及ANOVA方差分析檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR引物合成序列

2 結(jié)果

2.1 PJ34抑制高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞PARP-1的過表達(dá)

應(yīng)用高糖刺激大鼠腎臟系膜細(xì)胞，高糖組系膜細(xì)胞PARP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)較較低糖對照組明顯增加，分別較低糖對照組增加72.3%和68.4%（P＜0.05），PJ34組系膜細(xì)胞PARP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)分別減少為高糖組的31.8% 和 55.5%（P＜0.05）。見圖1～4。單純使用PJ34不影響系膜細(xì)胞PARP-1的表達(dá)。同時，高糖顯著誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞PARP-1激活，高糖組為低糖對照組活性的1.77倍（P＜0.05），給予PJ34預(yù)處理可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的PARP激活，活性降低為高糖組的67.8% （P＜0.05）。見圖5。

2.2 PJ34抑制高糖誘導(dǎo)大鼠腎臟系膜細(xì)胞FN及COLⅣ的過表達(dá)

應(yīng)用高糖刺激大鼠腎臟系膜細(xì)胞，高糖組系膜細(xì)胞COLⅣ和FN mRNA的表達(dá)較低糖對照組分別增加57.9%和54.5%（P＜0.05），PJ34顯著抑制高糖所致系膜細(xì)胞COLⅣ和FN mRNA的表達(dá)，分別減少為高糖組的68.2%和54.7%（P＜0.05）。見圖6、7。單純使用PJ34不影響系膜細(xì)胞COLⅣ和FN mRNA的表達(dá)。同時，高糖組系膜細(xì)胞COLⅣ和FN蛋白的表達(dá)較低糖對照組分別增加51.2%和36.9%（P＜0.05），PJ34組系膜細(xì)胞COLⅣ和FN蛋白的表達(dá)分別減少為高糖組的54.0%和66.6%（P＜0.05）。見圖8、9。單純使用PJ34不影響系膜細(xì)胞COLⅣ和FN的表達(dá)。

3 討論

糖尿病腎?。―N）是糖尿病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是發(fā)達(dá)國家終末期腎病的首要原因，我國近年來發(fā)病率也有不斷上升的趨勢。高血糖作為糖尿病的最基本生化特性，通過多種機(jī)制引起DN，其中氧化應(yīng)激是一個重要損傷機(jī)制。血糖通過多種機(jī)制引起DN，其中代謝途徑、糖基化終產(chǎn)物（AGEs）途徑、蛋白激酶C途徑以及己糖胺途徑是公認(rèn)的四個重要損傷機(jī)制[3]。DN研究表明，PARP和蛋白非酶糖基化、ROS生成異常、鈣代謝紊亂密切相關(guān)，PARP和糖尿病并發(fā)癥之間關(guān)聯(lián)的研究進(jìn)展成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

圖1 高糖組（25 mmol/L）誘導(dǎo)PARP-1mRNA表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用

圖2 高糖組（25 mmol/L）誘導(dǎo)PARP-1 mRNA表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用的統(tǒng)計圖（n=3）

圖3 高糖組（25 mmol/L）誘導(dǎo)PARP-1蛋白表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用

圖4 高糖組（25 mmol/L）誘導(dǎo)PARP-1蛋白表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用的統(tǒng)計圖（n=3）

圖5 高糖組（25 mmol/L）誘導(dǎo)PARP-1活性表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用的統(tǒng)計圖（n=3）

圖6 高糖組（25 mmol/L）誘導(dǎo)COLⅣ和FN mRNA的表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用

圖7 高糖組（25 mmol/L）誘導(dǎo)COLⅣ和FN mRNA的表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用的統(tǒng)計圖（n=3）

PARP是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶。主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，少量存在于細(xì)胞漿內(nèi)。它是能選擇性識別并結(jié)合DNA缺口的DNA結(jié)合蛋白酶，主要通過修復(fù)DNA單鏈及雙鏈斷裂在維持基因組的完整性方面發(fā)揮作用[4]。在糖尿病時，增高的細(xì)胞內(nèi)葡萄糖水平引起ROS大量釋放，DNA鏈嚴(yán)重?fù)p傷，以致PARP過度激活，而消耗大量NAD+及ATP，引起細(xì)胞能量供應(yīng)不足而壞死或凋亡，同時，NAD+及ATP的大量耗竭引起細(xì)胞抗氧化能力的嚴(yán)重削弱，引起氧化應(yīng)激損傷和Ca2+內(nèi)流的增加，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。另外，PARP調(diào)控了轉(zhuǎn)錄因子的活性，活化的PARP上調(diào)了大量因子的表達(dá)（TNF-α、一氧化氮合酶、內(nèi)皮素等），共同介導(dǎo)DN的發(fā)生。然而更為重要的是，PARP催化生成 ADPR，使GAPDH活性大大降低，因而激活上述四個重要損傷途徑。因此，可以想象PARP在DN的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。只要能特異地、完全地抑制PARP的過度表達(dá)，就可以抑制其下游的所有的病理損傷過程，阻斷高血糖對糖尿病腎組織細(xì)胞的損害，逆轉(zhuǎn)DN的全過程。

圖8 高糖組（25 mmol/L）誘導(dǎo)COLⅣ和FN蛋白表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用

圖9 高糖組（25 mmol/L）誘導(dǎo)COLⅣ和FN蛋白表達(dá)及PJ34的干預(yù)作用的統(tǒng)計圖（n=3）

ECM是細(xì)胞外大分子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)，主要包括膠原（collagen，COL）， 層粘連蛋白 （laminin，LN）， 纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）等，它的過度堆積或降解減少均視為病理性重塑，是腎臟病變發(fā)生，發(fā)展的主要原因。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)高糖刺激可以引起大鼠系膜細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)PARP激活，PARP-1表達(dá)升高，F(xiàn)N、COLⅣ蛋白和mRNA表達(dá)增加。再次證實(shí)了異常增高的高糖可導(dǎo)致腎臟系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)，引起細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。在此過程中，筆者同時觀察到PARP-1基因及蛋白表達(dá)的增高，提示PARP-1可能參與了高糖引起的腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。筆者還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PARP抑制劑PJ34干預(yù)后大鼠系膜細(xì)胞PARP-1表達(dá)降低，明顯改善了高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)FN、COLⅣ蛋白和mRNA表達(dá)增加。PJ34是一種新研制的選擇性PARP-1抑制劑，通過競爭性阻斷PARP分子上NAD+結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮作用，它的抑酶活性比以往的PARP抑制劑都強(qiáng)，是3-AB的1萬倍[5]。PJ34 的分子式為 C17H17N3O2·HCl，屬于菲啶酮類化合物，呈水溶性，口服和注射方式的生物利用度都高[6]。筆者的研究中運(yùn)用PJ34干預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)在抑制PARP-1表達(dá)的同時高糖誘導(dǎo)的指示細(xì)胞外基質(zhì)沉積的指標(biāo)也被顯著抑制了，進(jìn)一步提示PARP-1參與了高糖引起的腎小球細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。

既往有很多實(shí)驗也證實(shí)了抑制PARP-1活性可以改善高糖或者糖尿病所致的一系列病理結(jié)局。Choi等[7]發(fā)現(xiàn)PARP特異性抑制劑可以改善糖尿病小鼠冠狀動脈功能。同樣，有研究表明抑制PARP活性可以中和糖尿病小鼠的腎小球肥大及外周神經(jīng)病變[8]。在糖尿病神經(jīng)病變及視網(wǎng)膜病變的諸多研究中也觀察到抑制PARP可以改善上述病變[9-10]。筆者既往也發(fā)現(xiàn)抑制PARP可以顯著改善高糖所致腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化及纖維化[11]。對于糖尿病腎病，Szabo等[12]也發(fā)現(xiàn)在db/db糖尿病小鼠中，腎組織PARP活性增加，其特異性抑制劑可以減少小鼠尿蛋白、小球系膜增寬及足突細(xì)胞損傷。另外，其特異性抑制劑還可以抑制高糖刺激的體外培養(yǎng)的足突細(xì)胞的凋亡。筆者既往的研究也發(fā)現(xiàn)在下調(diào)PARP-1活性及表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎臟系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)積聚[13]。因此，研究和開發(fā)PARP抑制劑，將為臨床治療氧化應(yīng)激相關(guān)性疾病提供新策略和新方法，為DN的治療提供一個新的思路。

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