邱 慧 俞小衛(wèi) 韋國(guó)楨 張德平

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 常州 213003；2.，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 南京 210008

肺纖維化（pulmonary fibrosis）是大多數(shù)間質(zhì)性肺疾病的最終結(jié)局，其病理特點(diǎn)是彌漫性肺泡炎癥和肺泡上皮細(xì)胞損傷，組織修復(fù)失衡，成纖維細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，最終肺泡結(jié)構(gòu)破壞和肺纖維化形成。肺纖維化發(fā)病機(jī)制尚不明確，至今無(wú)有效治療藥物。國(guó)外學(xué)者在動(dòng)物肺纖維化模型的研究中證實(shí)，早期應(yīng)用姜黃素可以減輕肺纖維化程度，對(duì)肺纖維化具有預(yù)防作用[1-2]。本研究利用博萊霉素建立大鼠肺纖維化模型，在大鼠肺纖維化形成階段使用姜黃素干預(yù)，觀察姜黃素對(duì)已經(jīng)形成的肺纖維化的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

博萊霉素A5針劑 （天津太河制藥有限公司）；姜黃素（Sigma公司，c1386）；大鼠 IL-10 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（R&D生產(chǎn)，北京晶美生物技術(shù)公司分裝）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及造模方法

SPF級(jí)雄性SD大鼠 （南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）共72只，體重（180±20）g，按隨機(jī)對(duì)照表法分為正常對(duì)照組（24只）、博萊霉素組（24只）和姜黃素組（24只）。正常對(duì)照組：氣管內(nèi)一次性注入滅菌生理鹽水2 mL/kg，第15天起每日腹腔注射生理鹽水0.5 mL/kg；博萊霉素組：氣管內(nèi)一次性注入博萊霉素A5制劑5 mg/kg，第15天起每日腹腔注射6%乙醇和6%聚乙二醇混合溶液0.5 mL/kg；姜黃素組：氣管內(nèi)一次性注入博萊霉素A5制劑5 mg/kg，第15天起每日腹腔注射姜黃素 （溶于6%乙醇和6%聚乙二醇混合溶液）50 mg/kg。每組分別于第 14、17、21、28 天各處死 6 只大鼠（均從腹主動(dòng)脈取血5 mL后以放血法處死）。處死后，打開(kāi)胸腔，結(jié)扎右肺門(mén)，行左肺肺泡灌洗術(shù)，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）10 mL，置-70℃冰箱保存，備檢 IL-10含量。

1.3 肺組織病理分析

取右肺上葉，中性甲醛固定，取石蠟包埋，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅（HE）和Masson染色。由不參與實(shí)驗(yàn)過(guò)程的病理科醫(yī)師觀察病理切片。參照根據(jù)Szapiel等[3]的方法確定肺泡炎和肺纖維化程度，其分級(jí)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。肺泡炎分 4級(jí)，1級(jí)（0分）：無(wú)肺泡炎；2級(jí)（1分）：輕度肺泡炎，表現(xiàn)為單核細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增寬，病變僅限于局部和近胸膜部，受累面積小于全肺的20%；3級(jí)（2分）：中度肺泡炎，受累面積占全肺的20%～50%，近胸膜部較重；4級(jí)（3分）：重度肺泡炎，受累面積大于全肺的50%，偶見(jiàn)肺泡腔內(nèi)出血造成實(shí)變。肺纖維化分4級(jí)，1級(jí)（0分）：無(wú)纖維化；2級(jí)（1分）：輕度纖維化，受累面積小于全肺的20%，纖維化累及胸膜及胸膜下的肺間質(zhì)，肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂；3級(jí)（2分）：中度纖維化，受累面積占全肺的20%～50%，纖維化區(qū)域從胸膜向內(nèi)延伸，仍屬局部性；4級(jí)（3分）：重度纖維化，受累面積大于全肺的50%，并相互融合，其間可見(jiàn)大小不等的囊氣腔，肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞。最后累計(jì)總分。

1.4 BALF中IL-10含量測(cè)定

雙抗體夾心ELISA測(cè)定BALF中IL-10含量，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件處理全部數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變

光鏡觀察正常對(duì)照組未出現(xiàn)明顯的病理變化。博萊霉素組第14天時(shí)肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有少量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞輕度增生，肺泡間隔增寬；第17天時(shí)肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯，肺泡壁增厚，伴輕度出血；第21天時(shí)與第17天比較無(wú)明顯變化；第28天時(shí)肺泡壁明顯增厚，部分肺泡腔消失，由膠原纖維、成纖維細(xì)胞及淋巴細(xì)胞占據(jù)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，表明動(dòng)物模型復(fù)制成功。姜黃素組第17天時(shí)與博萊霉素組相似，第21天和28天時(shí)肺纖維化逐漸減輕，肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)有少量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔輕度增寬，肺泡結(jié)構(gòu)輕度異常。

2.2 肺泡炎評(píng)分

博萊霉素組和姜黃素組在第14、17、21、28天肺泡炎評(píng)分均高于正常對(duì)照組（均P＜0.05），但姜黃素組在第28天肺泡炎顯著輕于博萊霉素組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺泡炎評(píng)分（，分，n=6）

表1 各組大鼠肺泡炎評(píng)分（，分，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較，★P＜0.05；與博萊霉素組比較，△P＜0.05

組別 第14天 第17天 第21天 第28天正常對(duì)照組博萊霉素組姜黃素組0001.67±0.52★1.84±0.58★1.83±0.41★2.00±0.00★0.17±0.411.83±0.41★1.67±0.52★2.00±0.89★1.33±0.52★△

2.3 肺纖維化評(píng)分

博萊霉素組和姜黃素組在第14、17、21和28天肺纖維化評(píng)分均高于正常對(duì)照組（均P＜0.05），但姜黃素組在第21、28天時(shí)顯著輕于博萊霉素組（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 BALF中IL-10含量

博萊霉素組BALF中IL-10含量在第14、17天顯著高于正常對(duì)照組（均P＜0.05），但在第21、28天與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。姜黃素組BALF中IL-10含量在第14、17、21、28天顯著高于正常對(duì)照組 （均P＜0.05），且在第 21、28天顯著高于博萊霉素組（均 P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠肺纖維化評(píng)分（，分，n=6）

表2 各組大鼠肺纖維化評(píng)分（，分，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較，★P＜0.05；與博萊霉素組比較，△P＜0.05

組別 第14天 第17天 第21天 第28天正常對(duì)照組博萊霉素組姜黃素組00001.00±0.63★1.26±0.41★1.67±0.52★1.50±0.54★1.83±0.41★1.33±0.50★△2.17±0.98★1.17±0.41★△

表3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-10含量（，ng/L，n=6）

表3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-10含量（，ng/L，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較，★P＜0.05；與博萊霉素組比較，△P＜0.05

組別 第14天 第17天 第21天 第28天正常對(duì)照組博萊霉素組姜黃素組21.25±2.3526.56±3.04★25.37±2.04★22.08±2.1426.17±3.21★27.88±2.19★24.04±3.4624.06±2.5729.11±1.77★△23.19±1.5323.95±1.6232.60±2.26★△

3 討論

姜黃素是從姜科植物姜黃的地下根莖中分離出的主要活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑制血管新生等廣泛的生物活性。姜黃素具有保護(hù)腎臟、抑制肝纖維化、幫助肌肉損傷修復(fù)、治療白內(nèi)障、抗寄生蟲(chóng)病等多種藥理作用，且毒副作用小，使用安全，有良好的臨床應(yīng)用前景。高蔚等[4]研究證實(shí)姜黃素可以抑制肺纖維化大鼠成纖維細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其作用呈劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)性。張德平等[5]在大鼠肺纖維化的形成階段使用姜黃素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以減輕肺泡炎和肺纖維化程度，本研究對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

IL-10是已知的免疫和炎癥抑制因子，主要由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和致炎因子合成等生物學(xué)效應(yīng)。Yamamoto等[6]在人肺纖維母細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)IL-10可減少Ⅰ型膠原纖維和纖維連接蛋白的表達(dá)，對(duì)抗TGF-β1引起的膠原合成增多。Wilson等[7]研究報(bào)道IL-17缺乏明顯降低了博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化，而IL-10基因敲除小鼠可以使IL-17的主要分泌細(xì)胞Th17的反應(yīng)明顯增強(qiáng)，認(rèn)為IL-10可能通過(guò)抑制促炎因子IL-23/IL-17A活性，從而阻止了博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，博萊霉素組和姜黃素組在肺纖維形成早期（第14、17天）BALF中IL-10含量較正常對(duì)照組明顯增加，隨后博萊霉素組逐漸減弱。分析其原因，可能肺纖維化發(fā)生時(shí)，體內(nèi)致炎因子如TGF-β1等含量明顯增加，抑制抑炎因子產(chǎn)生，隨著病情的發(fā)展，這種抑制作用逐漸增強(qiáng)，最終導(dǎo)致炎性和抑炎性細(xì)胞因子之間失平衡，肺纖維化進(jìn)一步加重。而姜黃素組IL-10含量逐漸增加，證實(shí)姜黃素可以促進(jìn)抑炎因子IL-10的表達(dá)，阻止肺纖維化的進(jìn)展。但也有研究結(jié)論與之相反：Barbarin等[8]研究顯示，在二氧化硅所誘導(dǎo)的小鼠肺泡炎癥及纖維化階段，IL-10的過(guò)度表達(dá)加重了最終的肺纖維化，分析IL-10的致纖維化作用與促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子反應(yīng)，增加IL-4、IL-13的表達(dá)有關(guān)。IL-10對(duì)肺纖維化的作用復(fù)雜，尚需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，姜黃素通過(guò)促進(jìn)IL-10表達(dá)，對(duì)已經(jīng)形成的大鼠肺纖維化具有明顯的保護(hù)作用，為臨床使用姜黃素治療肺纖維化提供理論依據(jù)。

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[2]Venkatesan N.Pulmonary protective effects of curcumin against paraquat toxicity[J].Life Sci，2000，66（2）：PL21-28.

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[4]高蔚，張德平，陳碧.姜黃素對(duì)肺纖維化大鼠肺成纖維細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2009，32（1）：37-41.

[5]張德平，邱慧，莊誼，等.姜黃素干預(yù)對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30（3）：197-201.

[6]YamamotoT，EckesB，KriegT.Effectofinterleukin-10onthegeneexpression of typeⅠcollagen，fibronectin，and decorin in human skin fibroblasts：differential regulation by transforming growth factor-beta and monocyte chemoattractant protein-1[J].Biochem Biophys Res Commun，2001，281（1）：200-205.

[7]Wilson MS，Madala SK，Ramalingam TR，et al.Bleomycin and IL-1betamediated pulmonary fibrosis is IL-17A dependent[J].J Exp Med，2010，207（3）：535-552.

[8]Barbarin V，Xing Z，Delos M，et al.Pulmonary overexpression of IL-10 augments lung fibrosis and Th2 responses induced by silica particles[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，288（5）：L841-848.