阮時珍 阮曉東 李月桂 阮周希 黃巧珍 陳 強

(1.廈門市食用菌研發(fā)中心,福建 廈門 361100;2.福建農(nóng)林大學食品科學系,福州 350002;3.福建省寧德市華林微生物技術(shù)研究所,福建 寧德 352100;4.江西省贛州市創(chuàng)新生物科技研究院,江西 贛州 342100)

食用菌液體深層發(fā)酵技術(shù)屬于系統(tǒng)生物工程技術(shù),將微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),始于19世紀末20世紀初,而逐步應(yīng)用于食用菌領(lǐng)域,則源于1948年美國H.Humfeld等科學家對蘑菇深層發(fā)酵技術(shù)的成功探索。在我國,最早于1960年由上海植物生理研究所陳美聿等進行香菇深層發(fā)酵研究。上世紀80年代以來,關(guān)于食用菌生產(chǎn)的各種發(fā)酵設(shè)備研制的報道日益增多。目前液體菌種在國內(nèi)已應(yīng)用到杏鮑菇工廠化栽培上,先后在遼寧、北京、上海、廣州、福建、江蘇等地應(yīng)用推廣,效果較好。

液體菌種生產(chǎn)技術(shù)之所以被人們關(guān)注,是因為它與傳統(tǒng)食用菌子實體或菌種的生產(chǎn)方法相比,具有明顯的優(yōu)越性。在液體深層培養(yǎng)過程中,菌絲體能在發(fā)酵罐內(nèi)處于最適溫度、酸堿度、氧氣和碳氮比的條件下生長,呼吸產(chǎn)生的廢氣能及時排出,新陳代謝旺盛,菌絲生長迅速,在3～5天內(nèi)就能獲得大量可用于生產(chǎn)的液體菌種。液體菌種接入固體培養(yǎng)基培養(yǎng),具有流動快、分散性好、萌發(fā)迅速、菌絲生長快、覆蓋料面早等特點,可降低雜菌污染幾率,縮短生產(chǎn)周期,提高生產(chǎn)效益。這是固體菌種所不能比擬的。

1 發(fā)酵罐的系統(tǒng)組成

以100～200 L發(fā)酵罐為例,發(fā)酵系統(tǒng)由發(fā)酵罐、空氣過濾系統(tǒng)、電控系統(tǒng)等組成。發(fā)酵罐體分內(nèi)、外兩層,外層電加熱,兼做蒸汽發(fā)生器和降溫用;內(nèi)層做發(fā)酵罐,裝有提升管通氣道。空氣過濾系統(tǒng)由壓縮機、減壓閥、油水分離器、粗過濾、精過濾等組成。電控系統(tǒng)包括溫控儀、溫度探頭、時間繼電器等組件。

2 主要技術(shù)參數(shù)

2.1 液體菌種發(fā)酵罐 設(shè)計壓力為0.25 MPa,滅菌壓力≤0.15 MPa,滅菌溫度121～125℃。培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)器壓力0.03～0.05 MPa,夾層冷卻水壓力≤0.13 MPa。

2.2 空氣過濾系統(tǒng) 氣泵轉(zhuǎn)速為1 400 r/min,排氣量125 L/min,濾芯的過濾精度為0.01 UM,過濾效率99.99%,耐蒸汽125±2℃,200 h。

發(fā)酵溫度根據(jù)品種不同,可自行設(shè)定,然后由溫控器自控。

3 使用前的技術(shù)準備

使用前首先要檢查電源、電器、溫度探頭、儀表系統(tǒng)是否正常;檢查壓縮機是否正常運轉(zhuǎn);開動壓縮機,用0.15 MPa的壓力,檢查過濾器、管路、閥門、發(fā)酵罐的密封性能是否良好。發(fā)酵罐設(shè)備屬機電一體設(shè)備,操作人員使用前必須進行必要的培訓,以熟悉整個系統(tǒng)的工作原理、設(shè)備的性能,以及管路閥門的操作程序等。

4 發(fā)酵罐的使用與工藝流程

生產(chǎn)操作的程序:罐清洗檢查→培養(yǎng)基制備→上料→培養(yǎng)基滅菌→降溫→接種。

4.1 發(fā)酵罐的清洗檢查 發(fā)酵罐在每次使用后或再次使用前都必須對罐內(nèi)進行徹底的清洗。方法:用自來水管沖洗罐的內(nèi)壁,并徹底清除提升管通氣道上的異物。另外要檢查各個閥門、加熱器、溫度計保護套、控制柜和氣泵是否正常,如有故障,需及時排除。

正常情況下,上一批生產(chǎn)完畢后,一般只需對罐進行清洗,即可進入下一批生產(chǎn),而不需要空消。但遇以下情況時則需要對罐進行空消:①新罐初次使用;②上一罐感染雜菌;③更換生產(chǎn)品;④罐長時間不用。

空消的方法:關(guān)閉各部的閥門,加水至視鏡中線,啟動加熱器加熱,微開排氣閥加熱到 120～126℃維持30～40 min,然后放出煮罐里的水。

4.2 培養(yǎng)基制作 馬鈴薯10%、麩皮3%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸鎂0.075%、紅糖1%、蛋白胨0.2%、消泡劑0.035%。根據(jù)不同的品種采用不同的培養(yǎng)基配方,在沒有確定最佳配方時,多數(shù)品種都可以用本配方。

馬鈴薯挖芽、去皮洗凈后,切成0.2～0.4 cm的片和麩皮同放一起,用直徑24～30 cm的不銹鋼鍋 (或鋁鍋)分批煮至馬鈴薯酥而不爛時,用6～8層的紗布過濾取液,放入較大的塑料桶后,再煮一鍋紅糖和其他物料,一起攪拌熔化即可。要注意用于制作培養(yǎng)基的器具要單獨使用,不要沾染油污。

把制作好的培養(yǎng)基放入罐中后,加入自來水調(diào)整料液至標準水位線,進行滅菌。

4.3 培養(yǎng)基和精過濾器的滅菌 設(shè)定滅菌溫度在121～126℃,打開排氣閥,按啟動開關(guān),兩個加熱管開始加熱工作,于溫度達100℃時,排除冷空氣,有大量蒸氣排出時,方可關(guān)閉排氣閥。于溫度達到126℃,壓力為0.15 MPa時,要立即微開排氣閥,并開始計時30～40 min。氣路和精過濾器要同時用飽和蒸汽進行滅菌,消除所有死角和雜菌,確保系統(tǒng)處于無菌狀態(tài)。

4.4 降溫與冷卻 滅菌結(jié)束后,關(guān)閉所有的閥門,設(shè)定培養(yǎng)溫度為22～26℃,并應(yīng)立即通入冷水降溫,于壓力降至0.03～0.05 MPa時,開始通氣,調(diào)整發(fā)酵罐內(nèi)壓力為0.03～0.05MPa,至溫度降為22～26℃時開始罐內(nèi)接種。

4.5 發(fā)酵罐內(nèi)接種 準備好經(jīng)提前培養(yǎng)的300～500 mL的三角抽濾瓶裝液體種,先用95%的酒精火圈封住發(fā)酵罐上的接種口,逐漸打開接種閥門,待罐內(nèi)壓力降至0時,立即把準備好的菌種通過濾嘴快速倒入罐內(nèi),接種過程要在火焰保護下進行,關(guān)閉接種閥,調(diào)整罐內(nèi)的壓力到0.03～0.05 MPa,并檢查發(fā)酵罐、溫度和空氣流量。

4.6 發(fā)菌培養(yǎng) 依據(jù)不同品種設(shè)定不同培養(yǎng)溫度,一般為22～26℃,空氣流量調(diào)至1.2～2.0 m3/h,罐內(nèi)壓力在0.03～0.05 MPa之間。

培養(yǎng)期間不需專人管理,自接種24 h以后,每隔12 h可自接種口取樣一次,觀察菌種萌發(fā)和生長情況。通常觀測以下幾個指標:①菌液顏色澄清度,正常菌液顏色純正,雖有淡黃、橙黃、淺棕色等,但不渾濁;②菌液的氣味,正常的菌液有一種香甜味,隨著時間延長味道越來越淡;③菌液中菌球數(shù)量的增長情況,從無到有小菌球逐漸增多變大。一般品種整個培養(yǎng)周期為3～5天。菌種發(fā)酵終點的判斷依據(jù)是:①菌液取樣靜置5 min,菌球占整個菌液的80%～90%。菌球與菌液界線分明,周邊毛刺明顯,菌絲活力強。②液體的香甜味前期較濃,隨著培養(yǎng)時間的延長會越來越淡,取而代之的是菌絲的特有味道。③菌液的顏色變淺,澄清透明,營養(yǎng)耗殆。

4.7 栽培袋接種 于液體菌種達到質(zhì)量要求后便可進行接種。具體做法是:將接種管和接種槍接好,用8～10層紗布包好接種管及接種槍頭,在121～126℃的條件下滅菌40 min。在火焰的保護下將接種管裝到接種口上。調(diào)整發(fā)酵罐內(nèi)的壓力至0.03～0.05 MPa后,打開接種閥開始在接種室的超凈臺前進行接種。3個人配合操作較理想,其中一人搬運筐 (菌袋),一人開袋口,一人用注槍接種,要求孔內(nèi)和料面都布滿菌種,每袋接種量為10～15 mL。

5 液體菌種質(zhì)量檢查項目

5.1 菌液顏色和氣味的檢查 正常情況下,菌液初期略顯渾濁。隨著發(fā)酵的進行菌液逐漸變?yōu)榍宄?顏色越來越淡;若有污染發(fā)生,菌液始終處于渾濁狀態(tài),菌球與菌液的界限不明顯,且發(fā)酵液顏色出現(xiàn)異常變化。若污染雜菌或菌種質(zhì)量不好,菌液會有酸味、臭味、酒味或其他異常的氣味。因而在菌種培養(yǎng)過程中,工作人員要經(jīng)常聞一聞氣口排出的氣味是否正常。

6.2 菌種純度和狀態(tài)的檢查 接種24 h后,需每隔12 h從放料口取樣一次,進行純度檢查,經(jīng)過染色后,檢查有無雜菌,并通過染色的深淺判斷菌絲體的活力。正常的菌絲呈團狀,比較密集,邊緣有樹根狀分支;染有霉菌的,菌絲相對粗壯,且不成團:染有細菌的,菌絲較短且纖細。為了進一步檢查菌液是否有污染,可以采用準確度更高的方法,即將樣品接種于肉湯培養(yǎng)基,于恒溫下培養(yǎng),看是否有雜菌菌落長出。

放料接菌袋之前應(yīng)提前取樣檢查一下菌種的狀態(tài),正常菌絲應(yīng)呈球狀,分布較均勻,稍有粘稠,懸浮狀態(tài)較好,靜置5 min,菌球既不上浮也不下沉,菌液澄清透明,菌球與菌液界限明顯。