胡 衛(wèi)，方肇勤，梁 超，管冬元，吳中華

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203)

IFRD1(interferon-related developmental regulator 1，干擾素相關(guān)發(fā)育調(diào)節(jié)因子1)基因位于人染色體7q22～q31，含12個(gè)外顯子，核酸長度2604kb，該基因編碼的蛋白質(zhì)由453個(gè)氨基酸組成。已有資料表明，IFRD1在多種細(xì)胞中表達(dá)，尤其在組織增生或再生中顯著表達(dá)，提示該基因可能具有促進(jìn)組織增生的作用［1～3］。由于 IFRD1基因在上皮細(xì)胞、成肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種組織和細(xì)胞分化中均扮演一定的角色［4～6］，推測其可能是一個(gè)核蛋白，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，該基因在DEN誘發(fā)大鼠肝癌組織中表達(dá)升高，經(jīng) RNA干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該基因與肝癌細(xì)胞SMMC-7721的惡性增殖有關(guān)［7］。為進(jìn)一步探討其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制，我們采用基因芯片檢測了該基因表達(dá)下調(diào)后人肝癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的改變，本文重點(diǎn)關(guān)注細(xì)胞周期通路相關(guān)基因的變化。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞，購自中科院上海細(xì)胞生物所。

1.2 主要試劑和耗材

細(xì)胞培養(yǎng)耗材均為corning公司產(chǎn)品，主要試劑有 Trizol(GIBCO BRC)、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)、脂質(zhì)體lipo2000(Invitrogen);實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TAKARA，SYBR Premix Ex Taq:Perfect Real Time)、人類表達(dá)譜芯片(Affymetrix U133 Plus 2.0 array)、轉(zhuǎn)染載體(pSilencerTm2.1-U6 neo質(zhì)粒)和BamH I與Hind III限制性內(nèi)切酶均為Ambion公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為GENE公司的Rotor-Gene 3000;酶標(biāo)儀為 BIO-TEK公司的 ELX8001.3儀器。Agilent-bioanalizer 2100以及 Affymetrix的芯片雜交爐、芯片洗滌系統(tǒng)、芯片掃描儀等。

2 方法

2.1 人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的培養(yǎng)及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

肝癌細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1d取生長對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，消化后離心收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，重新用含血清不含抗生素的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞并分別等量加入新的培養(yǎng)皿中。實(shí)驗(yàn)分為正常組(SMMC-7721細(xì)胞)、G418組(SMMC-7721細(xì)胞 +G418)、陰性組(SMMC-7721細(xì)胞+G418+陰性載體對(duì)照)、RNAi組(SMMC 7721細(xì)胞+G418+IFRD1基因 shRNA)。細(xì)胞鋪皿后20h以內(nèi)進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，10cm培養(yǎng)皿每皿需15ml培養(yǎng)液 +2×1.5ml轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液(含 24.0 μg質(zhì)粒DNA+60 μL脂質(zhì)體)。轉(zhuǎn)染后第2天換成 G418培養(yǎng)液。-

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測干擾效率

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后第6天，收集各組細(xì)胞 Trizol法提取總 RNA。各實(shí)驗(yàn)組取2μg總 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以GAPDH為內(nèi)參做相對(duì)表達(dá)量分析，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測干擾效率。IFRD1基因干擾效率的檢測引物為:上游GCC CTG GAA TTG AAA GTG AA，下游 TGG GCA TAT GGT CAG CAG TA，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為299bp。GAPDH內(nèi)參基因的引物分別為:上游 GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT，下游 TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為238bp。

擴(kuò)增反應(yīng)體系(共計(jì) 25μL)為:消毒雙蒸水9.5μL，SYBR Premix Ex Taq(2 × )12.5μL.上、下游引物(各 5μmol/L)2μL.RT產(chǎn)物 1μL擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃ ×30s;95℃ ×5s，60℃ ×30s，40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用△△CT法加以分析。

2.3 基因芯片檢測

Trizol法抽提總 RNA后，采用 RNeasy Mini Kit試劑盒純化RNA，然后將純化的RNA樣品送至上海生物芯片有限公司進(jìn)行 RNA質(zhì)量鑒定(毛細(xì)管電泳)及其后續(xù)的人基因組表達(dá)譜檢測(芯片型號(hào)U133 plus 2.0 array，合同號(hào)為 CB2009559)。

2.4 芯片數(shù)據(jù)分析

芯片數(shù)據(jù)分析方法，在參考Affymetrix genechip網(wǎng)站的技術(shù)手冊基礎(chǔ)上，充分利用上海生物芯片有限公司在線的SBC分析系統(tǒng)進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)處理與分析。

篩選芯片數(shù)據(jù)中細(xì)胞周期通路相關(guān)基因，找出表達(dá)量變化在1.1倍及以上的基因(上調(diào)1.1或下調(diào)0.91)，并用GenMAPP軟件分析對(duì)照組與干擾組各基因的比值，以不同顏色標(biāo)示其上調(diào)和下調(diào)的倍數(shù):比值 ＞=1.5(紅色)，＞=1.2(粉紅)，＞=1.1(玫瑰紅);比值 ＜=0.67(藍(lán)色)，＜=0.83(淡藍(lán)色)，＜ =0.91(灰色)。

3 結(jié)果

3.1 IFRD1基因的干擾效率

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn)，IFRD1干擾組目的基因的表達(dá)量下降，相對(duì)表達(dá)量陰性組為3.97，RNAi組為 2.53(圖1、圖 2)。

3.2 各組細(xì)胞總RNA質(zhì)檢及轉(zhuǎn)錄特征

圖1 IFRD1擴(kuò)增曲線圖

圖2 RNAi后各組IFRD1表達(dá)量

由RNA質(zhì)檢結(jié)果(表1和圖3～圖7)可以看出，基準(zhǔn)峰后18S和28S峰清楚，中間無雜帶污染，說明各組細(xì)胞抽提的RNA沒有出現(xiàn)降解現(xiàn)象。

表1 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

圖3 RNA ladder電泳結(jié)果

圖4 正常組RNA電泳結(jié)果

圖5 G418組RNA電泳結(jié)果

圖6 陰性組RNA電泳結(jié)果

圖7 RNAi組RNA電泳結(jié)果

3.3 芯片結(jié)果

3.3.1 干擾基因的表達(dá) 在數(shù)據(jù)表中，找到IFRD1基因2個(gè)對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄本，其RNAi實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的比值分別為0.71(1555/2178)與0.69(4434/6427)，與前面PCR檢測結(jié)果近似，提示該基因經(jīng)RNAi后，發(fā)生了部分降解，出現(xiàn)表達(dá)后沉默現(xiàn)象。

3.3.2 細(xì)胞周期通路基因改變 (1)周期蛋白、CDK、CKI表達(dá)變化。在真核細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞周期主要由周期蛋白(cyclin)-周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)-周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)三者形成的1個(gè)精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行監(jiān)督調(diào)控。在細(xì)胞周期中，細(xì)胞周期蛋白 cyclins是CDK的正向調(diào)節(jié)因子，CKI為CDK的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。表2和圖8顯示，IFRD1干擾后，細(xì)胞周期蛋白cyclin和CDK表達(dá)以上調(diào)為主，而抑制因子 CKI以下調(diào)為主，表明細(xì)胞處于生長期;(2)S期DNA合成相關(guān)基因表達(dá)變化。表3圖8顯示，在 S期染色體 DNA復(fù)制前，要求G1期染色體處于復(fù)制前感受狀態(tài)，該狀態(tài)需要前復(fù)制復(fù)合物(PLC)結(jié)合在復(fù)制起點(diǎn)上。PLC由DNA復(fù)制起點(diǎn)識(shí)別復(fù)合體(ORC)、微型染色體維持蛋白復(fù)合物(MCM)以及CDC6和CDC45組成。這種處于復(fù)制前狀態(tài)的染色體必須在特定的CDK-cyclin作用下才能啟動(dòng)DNA復(fù)制。ORC由ORC1L、ORC2L、ORC3L、ORC4L、ORC5L、ORC6L 6 個(gè)亞基構(gòu)成，均參與 DNA 復(fù)制，其中亞基 1、2、4、5在復(fù)制啟動(dòng)中發(fā)揮重要的功效。微型染色體維持蛋白基因家族由 MCM2、MCM3、MCM 4、MCM 5、MCM 6、MCM 7組成蛋白復(fù)合體，均參與DNA復(fù)制、復(fù)制啟動(dòng)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等環(huán)節(jié)。IFRD1干擾后，MCM蛋白復(fù)合體以下調(diào)為主，ORC表達(dá)均下調(diào)，而 CDC6和 CDC45表達(dá)也下調(diào)，提示 RNAi組細(xì)胞 S期 DNA合成不活躍，染色體復(fù)制受阻;(3)細(xì)胞周期其他相關(guān)分子的變化。表4圖8顯示，從芯片結(jié)果可以看出，G1/S期檢測點(diǎn) p21、p57表達(dá)均下調(diào)，說明 G1/S期轉(zhuǎn)化順利;G2-M期檢測點(diǎn)關(guān)鍵基因如MAD2L1、MAD2L2和BUB3等表達(dá)均上調(diào)，提示細(xì)胞有絲分裂受阻，細(xì)胞不能順利從G2期進(jìn)入M期分裂增殖;一些抑制細(xì)胞增殖因素如 TP53、MDM2表達(dá)均上調(diào)，亦提示細(xì)胞分裂增殖不活躍。

表2 IFRD1 RNAi后細(xì)胞周期通路CDK及相關(guān)分子表達(dá)

表3 IFRD1 RNAi后細(xì)胞周期通路S期DNA合成相關(guān)基因表達(dá)變化

圖8 細(xì)胞周期基因表達(dá)量變化

圖9 G1-S基因表達(dá)量變化

4 討論

基因芯片技術(shù)因其可以同步開展成千上萬個(gè)基因表達(dá)的檢測，形成較為完整的細(xì)胞基因表達(dá)譜，具有高通量、高速度、平行化等優(yōu)點(diǎn)，成為目前研究基因表達(dá)的最有力的工具之一。近年來，該技術(shù)在中醫(yī)藥防治腫瘤的研究中得到了廣泛的應(yīng)用［8］。本研究在RNA干擾下調(diào) IFRD1基因表達(dá)水平后，采用人類表達(dá)譜芯片檢測該基因在肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低后引起肝癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化，以期闡明其影響肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

表4 IFRD1 RNAi后細(xì)胞周期通路其它基因的變化

“細(xì)胞周期”也稱“細(xì)胞分裂周期”，是指一個(gè)細(xì)胞經(jīng)生長、分裂而增殖成2個(gè)細(xì)胞的全過程，依次分為G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和 M期(有絲分裂期)。細(xì)胞周期的準(zhǔn)確調(diào)控對(duì)生物的生存、繁殖、發(fā)育和遺傳十分重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，IFRD1干擾后引起大量基因的變化。芯片結(jié)果顯示，細(xì)胞周期蛋白和CDK表達(dá)上調(diào)為主，CKI表達(dá)下調(diào)為主，提示細(xì)胞周期比較活躍;G1/S期檢測點(diǎn)p21、p57表達(dá)均下調(diào)，表明 G1-S期轉(zhuǎn)換順利;但S期DNA合成相關(guān)基因以下調(diào)為主，提示S期 DNA合成受到抑制，有絲分裂檢測點(diǎn)受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖分裂受限。這可能是IFRD1基因RNA干擾后導(dǎo)致人肝癌細(xì)胞增殖變緩的機(jī)制。

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