李妙齡，唐漢慶，王 勇，郭 健，龐宇舟，李國彰△

(1.瀘州醫(yī)學院，四川 瀘州 646000;2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029;3.廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530001)

苦參堿(Matrine)是從豆科植物苦參(sophora flaescens Ait)、苦豆子(S.alopecuroides L)及廣豆根(S.subrostrata)中分離出來的生物堿，是白金雀八堿的異構體，屬于四環(huán)的喹嗪啶類，分子式為C15H24N20，是苦參的主要成分。已有研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿有抗心律失常作用［1］，能拮抗烏頭堿、氯化鋇、哇巴因、腎上腺素以及結扎左冠狀動脈前降支誘發(fā)的心律失常，且其抗心律失常作用隨劑量的增加而加強，其對烏頭堿所致的心律失常作用尤佳，但確切的抗心律失常機制尚不明確。本研究應用標準微電極技術和細胞膜片鉗全細胞記錄技術，觀察在烏頭堿誘發(fā)心律失常的條件下，苦參堿對豚鼠心室肌動作電位及細胞膜鈉通道(INa)的作用，研究其抗心律失常的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

豚鼠，雌雄不限，體重300g～400g，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 主要藥品與試劑

苦參堿購于國家標準物質(zhì)網(wǎng)，純度大于99%，用水溶解;Collagenase II購于 Worthington公司;HEPE購于sigma試劑公司。

1.3 方法

1.3.1 豚鼠心室乳頭肌動作電位的記錄［2］

將豚鼠擊頭致昏后，迅速分離心臟置于100%O2飽和的臺式液中(mmol·L－1:NaCl 147，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.05，HEPES 10，Glucose 11，NaOH調(diào)節(jié) pH至7.4)，快速分離心室乳頭肌后固定于恒溫浴槽中，以持續(xù) 100%O2、溫度為 36℃ ±0.5℃的臺氏液灌流，流速3ml·min－1，平衡2h后用于實驗。用鉑金電極置于肌條的兩側作為刺激電極，用有芯玻璃毛細管(Havard，USA)在拉制儀(P-97，Sutter，USA)上進行拉制，將充灌 3mol·L－1KCl的玻璃微電極(阻抗 20～30 MΩ)插入 Ag-AgCl引導電極，固定于三維微操縱器(Narishige，Japan)上，用參比電極接地。電極入水后調(diào)零，緩慢插入電極至出現(xiàn)靜息電位(RP)時，由電子刺激器(SEN 7203，Nihon Kohden，Japan)發(fā)放刺激脈沖(2ms，1.5倍閾電壓)，通過隔離器(SS-202J，Nihon Kohden，Japan)將形成的場刺激作用于豚鼠乳頭肌，誘發(fā)乳頭肌的動作電位。引導的生物信號通過微電極放大器(MEZ 7200，Nihon Kohden，Japan)放大后應用生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420 E+，泰盟，成都)在計算機上進行實時采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3.2 豚鼠心室乳頭肌的細胞分離方法 開胸迅速取出心臟，置于氧飽和的4℃無鈣臺式液中(mmol·L－1:NaCl 135;KCl 5.4;MgCl21;NaH2PO40.33;Glucose 10;HEPES 5;NaOH調(diào)pH至7.4)，輕輕擠壓心臟、排出殘血。迅速將心臟移至Langendorff裝置上(恒溫37℃)，先用氧飽和的無鈣臺式液灌流 5min，流速 10ml.min－1，然后用酶液(CaCl234μM，CollagenaseⅡ 0.4mg/ml，323U/mg)進行灌流，消化時間約10min。最后，將心臟置于KB液中剪碎心室，用吸管輕輕吹打，用尼龍網(wǎng)過濾后用KB液(mmol· L－1:KOH 80;KCl 40;KH2PO425;MgSO43;Glutamic acid 50;Taurine 20;EGTA 0.5;HEPES 10;Glucose 10，pH值用 KOH調(diào)至7.2)保存細胞。

1.3.3 膜片鉗全細胞記錄方法［3］將分離獲得的心肌細胞置于浴槽中，用細胞外液(mmol·L－1:CsCl 107.5，NaCl 30，MgCl21，CaCl21，HEPES 20，Glucose 11，CoCl22，CsOH 調(diào) pH 至 7.35)灌流約10min。在倒置相差顯微鏡下選擇呈桿狀、橫紋清楚、立體感強、無皰疹、無收縮的細胞進行膜片鉗全細胞記錄。玻璃微管電極經(jīng)三步拉制而成，充填電極液后阻抗在2～4 MΩ。電極內(nèi)液成分為:(mmol·L－1:CsF 135，NaCl 5，HEPES 5，EGTA 10，Mg-ATP 5，CsOH調(diào)pH至7.2)。通道電流信號經(jīng)膜片鉗放大器(Axopatch 200B)放大后，經(jīng)模/數(shù)(A/D)數(shù)模(D/A)轉換器轉換后輸入計算機應用Clamplex軟件采集儲存，采樣頻率20KHz，低通濾波2KHz，串聯(lián)阻抗補償70% ～80%，漏電流用“P/4”補償。高阻抗封接形成后給予短促負壓吸破細胞膜，即形成全細胞模式，即可進行鈉通道電流的記錄。膜片鉗實驗在室溫20℃ ～25℃下進行。為消除細胞間的誤差，實驗結果均用電流密度表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

動作電位記錄實驗觀察靜息電位水平(RP)、動作電位幅度(APA)、動作電位復極到50%和90%時程(APD50，APD90)。膜片鉗實驗所得數(shù)據(jù)采用Clampfit軟件進行處理，以 Sigmplot軟件作圖，通道電流幅度以電流密度表示，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，以t檢驗進行分析統(tǒng)計，以P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 苦參堿對豚鼠心室乳頭肌動作電位的影響

在1Hz的刺激頻率下，在穩(wěn)定記錄動作電位20min后累加加入 10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L苦參堿(見Fig1)，每種濃度加藥時間為20min，可觀察到苦參堿濃度依賴性的延長動作電位時程。從Table 1(n=8)統(tǒng)計結果觀察到，10μmol/L對動作電位各參數(shù)沒有明顯作用，50μmol/L和100μmol/L能明顯延長 APD50和 APD90(P＜0.01)，100μmol/L能降低動作電位幅度(P＜0.05)。

圖1 不同濃度苦參堿對豚鼠乳頭肌動作電位的影響

表1 苦參堿對豚鼠乳頭肌動作電位的影響

2.2 在Aconition作用下苦參堿對豚鼠心室乳頭肌動作電位的影響

在正常臺式液中，記錄到穩(wěn)定動作電位后加入1μmol/L Aconition10min后可觀察到動作電位時程顯著延長，動作電位幅度稍有升高，在此基礎上分別加入 50μmol/L和 100μmol/L苦參堿 20min后，可觀察到動作電位時程隨著苦參堿濃度的增加而逐漸減小，趨向于正常對照組，同時其動作電位幅度稍下降。

2.3 苦參堿對鈉通道(INa)電流密度的影響

圖2 不同濃度苦參堿對烏頭堿誘導的豚鼠乳頭肌動作電位的影響

記錄INa電極內(nèi)液用Cs+代替K+可防止鉀電流的干擾，細胞外液中加入 CoCl2可阻斷鈣電流。在室溫條件下，保持電位(holding potential HP)為－90mV，從 －90 mV去極化到 +30 mV，階躍為 +5 mV，持續(xù)時間為40ms的刺激方案下可記錄到一典型的內(nèi)向電流，該電流在－60 mV開始激活，在－45 mV時達到最大，之后電流逐漸減小，在+20 mV電流消失。該電流的電流-電壓關系圖呈鐘形。記錄到穩(wěn)定電流后，分別加入苦參堿10μmol/L、50μmol/L和 100μmol/L(Fig3)，觀察到苦參堿 10μmol/L 對INa沒有明顯作用，50μmol/L可使 INa減小，累加給藥到100μmol/L又使該電流增大，接近對照組電流密度，表現(xiàn)出苦參堿對心律失常的雙向作用。

圖3 苦參堿對豚鼠乳頭肌鈉通道(INa)電流密度的影響

3 討論

本實驗結果表明，在正常豚鼠心室乳頭肌細胞上，苦參堿能適度延長動作電位時程，且呈濃度依賴性。對APD90作用較明顯，對 APA有減小作用，苦參堿在50μmol/L時可降低INa電流密度，在 －50mV～－35 mV作用較為明顯，但在100μmol/L時這種作用逐漸消失，表現(xiàn)為苦參堿對該通道具有雙向作用。

早在2002年黃彩云［1］應用烏頭堿、氯化鋇、氯化鈣-乙酰膽堿混合液制備大鼠心律失常模型，觀察到15μmol/L和30μmol/L苦參堿均能對抗這幾種心律失常模型所致的室性心律失常，主要表現(xiàn)為降低心律失常的持續(xù)時間和發(fā)生率，但確切的作用機制還不清楚，推測可能是通過改變心肌細胞膜鉀、鈣和鈉離子通道特性，降低心肌應激性，延長不應期，從而抑制異位節(jié)律點。本實驗觀察到，在正常心肌細胞上，苦參堿能濃度依賴性地延長動作電位時程，表現(xiàn)為適度延長動作電位時程。烏頭堿為致心律失常藥物，能明顯延長動作電位時程，在此基礎上加入50μmol/L和100μmol/L，可使過度延長的動作電位時程適度減小，趨向于較為正常的動作電位時程。這可能是苦參堿抗心律失常的作用機制，也是傳統(tǒng)中藥的一個特點，其實驗結果與2004年 Shanhong LI［4］等在大鼠心室肌細胞上的結果相似，即能使心律失常狀態(tài)下的心肌細胞動作電位趨于正常，改變心肌有效不應期的不均一性。從抗心律失常的多靶點學說和最佳靶點學說可知［5］，有效的抗心律失常藥物是能夠作用于多靶點，內(nèi)向電流和外向電流達到平衡，表現(xiàn)為較為正常的動作電位，因此認為一個理想的抗心律失常藥物應使動作電位時程恢復致接近正常的水平?？鄥A在烏頭堿誘發(fā)心律失常的病變作用下表現(xiàn)為使動作電位時程和動作電位幅度恢復接近正常狀態(tài)，可能是苦參堿有效抗心律失常的機制之一。

鈉通道電流是誘發(fā)產(chǎn)生動作電位的主要離子電流，該電流的異常將影響細胞的傳導性和興奮性，改變細胞的自律性，是抗心律失常的主要靶點。本研究觀察到，苦參堿在50μmol/L能明顯抑制 INa的電流密度，苦參堿濃度達到100μmol/L時這種抑制作用消失，表現(xiàn)為雙向的藥理作用，提示這種藥物在不同濃度下表現(xiàn)為不同的藥理作用。已有研究表明，烏頭堿［6］可使 INa通道持續(xù)開放，加速 Na+內(nèi)流，促使心肌細胞膜去極化而誘發(fā)心律失常。而本研究中觀察到，苦參堿具有抑制鈉通道電流的作用，這表明苦參堿能夠?qū)篂躅^堿所致的心律失常，可能與其對鈉通道的抑制作用相關。

單純苦參堿能夠延長動作電位時程，因此苦參堿的抗心律失常作用是多靶點的，對鈉通道、鈣通道及各種加通道均有一定的作用。已有研究顯示［7］，苦參堿與目前常用的抗心律失常藥物如胺碘酮相比，對各通道的作用相對緩和。在整體水平上［8］觀察到，苦參堿能對抗多種心律失常模型誘導的心律失常，表明這種相對緩和的藥理作用具有抗心律失常作用，這種相對較弱的作用能夠保證該藥物安全有效，且無毒副作用，因此揭示該藥的抗心律失常的作用機制，對開發(fā)該藥物的臨床應用價值尤為重要。

［1］黃彩云，謝世榮，黃勝英.苦參堿抗心律失常作用的實驗研究［J］.大連醫(yī)科大學學報，2002，24(3):176-179.

［2］李妙齡，曾曉榮，楊艷.多非利特與維拉帕米聯(lián)合應用對豚鼠乳頭肌動作電位的影響［J］.四川大學學報，2009，40(5):834-838.

［3］李妙齡，曾曉榮，楊艷.一種改進的人體心房肌細胞分離方法［J］.生理學報，2007，59(6):858-864.

［4］SHAN Hong-lI，YANG Bao-feng，ZHOU Yu-hong，et al.Effects of Matrine on Aconitine－Induced Electrophysiological Changes in Rat Ventricular Myocytes.［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences ，2004，13(3):193-198.

［5］楊寶峰，龔冬梅.抗心律失常藥物作用最佳靶點研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學學報，2002，18(1):1-5.

［6］汪玲芳，尹永強，趙臨.?；撬徭V對烏頭堿致大鼠心肌細胞心律失常模型鈉離子通道的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(5):611-614.

［7］許超千，董德利，杜智敏.苦參堿、小檗胺與胺碘酮、RP58866抗心律失常作用的比較［J］.藥學學報，2004，39(9):691-694.

［8］沈映君.中藥藥理學［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1997:612.