孫 鑫，鄧洋洋，燕 燕，王思程，尚德陽(yáng)，李 楠，鄭洪新

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis OP)是以骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞為特征，繼而導(dǎo)致骨脆性增加和骨折危險(xiǎn)性增高的1種全身性骨骼疾病［1］。本病發(fā)病機(jī)制尚未闡明，其發(fā)生與諸多因素有關(guān)。

中醫(yī)認(rèn)為，腎主骨骨病首責(zé)于腎，“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也;髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足者則骨強(qiáng)”(清·唐宗?！吨形鲄R通醫(yī)經(jīng)精義·臟腑所合》)。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠腎組織PKCα與PKCβ2蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，旨在探索骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制以及補(bǔ)腎益髓中藥的防治作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雌性4～5月齡 wistar大鼠169只，體重230g～270g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物

實(shí)驗(yàn)藥品:補(bǔ)腎壯骨益髓中藥(牡蠣、鹿茸等)。對(duì)照藥品:骨疏康顆粒劑(遼寧康辰藥業(yè)有限公司)、蓋天力片(東盛科技啟東蓋天力制藥股份有限

2公司)、健脾中藥補(bǔ)中益氣湯方(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供)。

1.3 試劑

兔抗 PKCα一抗(Santa Cruz)，兔抗 PKCβ2一抗(Santa Cruz)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG(北京中山生物公司)，堿性磷酸酶(ALP)偶聯(lián)的羊抗兔抗體(北京中山生物公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

1組:正常組;2組:假手術(shù)組;3組:模型組;4組:補(bǔ)腎中藥低劑量組(低劑量組);5組:補(bǔ)腎中藥高劑量組(高劑量組);6組:補(bǔ)中益氣湯對(duì)照組(健脾組);7組:蓋天力鈣片對(duì)照組(蓋天力組);8組:骨疏康顆粒對(duì)照組(骨疏康組)。

2.2 造模方法

手術(shù)摘除大鼠雙側(cè)卵巢的方法建立骨質(zhì)疏松癥模型。假手術(shù)組大鼠僅切開皮膚及皮下組織暴露雙側(cè)卵巢，但不摘除。正常組不手術(shù)。

2.3 飼養(yǎng)方法

正常組及假手術(shù)組大鼠正常飲水，其他各組大鼠正常飲水的同時(shí)給予相應(yīng)的藥物灌胃，每日1次，共3個(gè)月。大鼠等效劑量按成人每日用藥量的6.3倍計(jì)算，容積為0.875ml/100g體重。

2.4 取材

實(shí)驗(yàn)大鼠在最后1次灌胃后，禁食24h后取材。大鼠經(jīng)10%水合氯醛注射麻醉(0.3ml/100g體重)后，用碘伏消毒手術(shù)部位并采集標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)保留標(biāo)本包括腎(置高壓滅菌 EP管內(nèi) －70℃保存)、左后肢股骨(置塑料保鮮袋內(nèi) －70℃冰箱凍存)、子宮(稱取濕重)。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法 統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5方差分析法，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x珋±s)表示。

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物模型評(píng)價(jià)

(1)骨密度 通過雙能X線骨密度分析儀(附帶“The Small Subject Scout Scan”軟件)對(duì)大鼠離體股骨進(jìn)行檢測(cè)(掃描寬度15cm，長(zhǎng)度可任意調(diào)節(jié)，掃描速度40mm/sec，分辨率為1.0×1.0 mm;結(jié)果采用單位面積內(nèi)的骨礦物質(zhì)含量(g/cm2)表示)，通過統(tǒng)計(jì)所得結(jié)果如下。與正常組比較，模型組大鼠股骨頭骨密度顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，補(bǔ)腎中藥高劑量組可顯著增加骨密度(P＜0.01)，而健脾中藥作用不明顯，與補(bǔ)腎中藥高劑量組差異顯著(P＜0.01);(2)子宮指數(shù):實(shí)驗(yàn)大鼠子宮指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與正常組、假手術(shù)組相比較，模型組子宮指數(shù)明顯降低(P＜0.01);(3)大鼠行為學(xué)指標(biāo):正常組大鼠皮毛光澤、活潑喜動(dòng)、反應(yīng)靈敏、食欲佳、無豎毛、弓背、聚堆等表現(xiàn)。模型組大鼠均出現(xiàn)弓背塌腰表現(xiàn)，其他表現(xiàn)如毛色變淡、蜷縮、聚堆、反應(yīng)遲鈍、喜靜懶動(dòng)、抗應(yīng)激能力下降等癥狀不十分明顯，補(bǔ)腎中藥高劑量組、補(bǔ)腎中藥低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組的弓背塌腰表現(xiàn)較模型組為輕。用藥各組弓背塌腰癥狀改善率為:低劑量組33.3%，高劑量組52.4%，健脾組15.8%，蓋天力組30%，骨疏康組25%。

表1各組大鼠左后肢離體股骨骨密度比較(±s)

表1各組大鼠左后肢離體股骨骨密度比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05;與正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.05，與模型組比較:##P＜0.01;與低劑量比較:●P＜0.05;與低劑量比較:●●P＜0.01;與高劑量比較:☆P＜0.05，與高劑量比較:☆☆P＜0.01

組 別 例數(shù) 全股骨骨密度(g/cm2)正 常 組15 0.16433±0.01466##假 手 術(shù) 組 17 0.15582±0.01138##模 型 組 21 0.14700±0.01035＊＊低 劑 量 組 21 0.15186±0.01285＊＊☆高 劑 量 組 21 0.16095±0.01593##●健 脾 組 19 0.14211±0.01127＊＊●☆☆骨 疏 康 組 20 0.14835±0.01483＊＊☆☆蓋 天 力 組 20 0.15695±0.00778#

表2各組藥物對(duì)腎虛骨質(zhì)疏松大鼠子宮指數(shù)影響的比較(±s)

表2各組藥物對(duì)腎虛骨質(zhì)疏松大鼠子宮指數(shù)影響的比較(±s)

注:同表1

組別 例數(shù) 子宮指數(shù)正 常 組 15 2.0434±0.7178##假 手 術(shù) 組 17 1.8195±0.4311##模 型 組 21 0.2859±0.0469＊＊低 劑 量 組 21 0.2930±0.0501＊＊高 劑 量 組 21 0.3110±0.0694＊＊健 脾 組 19 0.2773±0.0435＊＊骨 疏 康 組 20 0.2835±0.0170＊＊蓋 天 力 組 20 0.2888±0.0684＊＊

從以上結(jié)果分析，本次實(shí)驗(yàn)骨質(zhì)疏松癥大鼠模型造模成功，且以弓背塌腰癥狀為腎虛模型的表征信息，補(bǔ)腎各組優(yōu)于其他各模型組。

3.2 實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織 PKCα及 PKCβ2的蛋白表達(dá)情況

3.2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織 PKCα蛋白表達(dá)情況

表2顯示，正常組與假手術(shù)組無差異;與正常組相比較，低劑量組無差異，而其他各組均存在顯著差異(P＜0.01);與模型組相比較，正常組、假手術(shù)組、低劑量組、高劑量組存在顯著差異(P＜0.01)，補(bǔ)脾組及蓋天力組有差異(P＜0.05)，骨疏康組無差異;與低劑量組相比較，正常組及假手術(shù)組無差異，模型組及其他各用組均存在顯著差異(P＜0.01);與高劑量組相比，其他各組均存在顯著差異(P＜0.01)(圖1-1)。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織 PKCβ2的蛋白表達(dá)情況 表2顯示，正常組與假手術(shù)組無差異;與正常組相比較，低劑量組無差異，而其他各組均存在顯著差異(P＜0.01);與模型組相比較，正常組、假手術(shù)組、低劑量組、高劑量組存在顯著差異(P＜0.01)，補(bǔ)脾組、骨疏康組及蓋天力組無差異;與低劑量組相比較，正常組及假手術(shù)組無差異，模型組及其他各用組均存在顯著差異(P＜0.01);與高劑量組相比，其他各組均存在顯著差異(P＜0.01)(圖2-1)。

圖1 蛋白表達(dá)電泳圖(Western blotting法)

圖2 蛋白表達(dá)電泳圖(Western blotting法)

4 討論

4.1 骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用的骨質(zhì)疏松癥模型是一種比較成熟的模型，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院、世界衛(wèi)生組織都推薦用此模型作為研究骨質(zhì)疏松的最佳模型。大鼠分布廣，繁殖快，生命周期短，便于飼養(yǎng)，費(fèi)用較低，是目前研究骨質(zhì)疏松使用最多、最成熟的造模動(dòng)物。Wistar大鼠具有對(duì)傳染病的抵抗力較強(qiáng)，自發(fā)性腫瘤發(fā)生率低等特點(diǎn)，十分適合用來進(jìn)行與老年性疾病相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

在本實(shí)驗(yàn)中通過觀察發(fā)現(xiàn)，去卵巢動(dòng)物模型術(shù)后早期階段出現(xiàn)了弓背塌腰的表現(xiàn)，是典型的腎虛癥狀，應(yīng)用補(bǔ)腎中藥后這些癥狀緩解或消失，由此我們認(rèn)為此模型屬腎虛，腎虛不能生髓，則髓減，使骨失所養(yǎng)，骨枯髓減導(dǎo)致“骨痿”。

4.2 骨質(zhì)疏松癥與腎的關(guān)系

中醫(yī)認(rèn)為，腎主骨，骨病首責(zé)于腎。腎虛可能是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的病機(jī)之一。“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也;髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi).髓足者則骨強(qiáng)”(清·唐宗?！吨形鲄R通醫(yī)經(jīng)精義-臟腑所合》)。腎虛的機(jī)制是復(fù)雜的。本實(shí)驗(yàn)選取腎組織進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)，一方面是探討骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制及其治療，另一方面可以為研究腎虛的機(jī)制提供生物學(xué)依據(jù)。

4.3 PKC與骨質(zhì)疏松癥的研究

蛋白激酶C(PKC)是1977年在鼠腦的胞質(zhì)成分中發(fā)現(xiàn)的一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶，由多種同工酶亞型組成，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員之一，以其活性依賴于Ca2+而得名，參與多種生命活動(dòng)，如蛋白磷酸化、信號(hào)傳遞、細(xì)胞增殖和分裂、跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)、平滑肌收縮、基因表達(dá)等。［2］本實(shí)驗(yàn)選取PKCα與PKCβ2作為研究對(duì)象，應(yīng)用補(bǔ)腎益髓中藥對(duì)模型大鼠進(jìn)行干預(yù)。

1997年崔家鵬等對(duì)腎虛骨質(zhì)疏松癥大鼠紅細(xì)胞膜PKC的活性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，腎虛骨質(zhì)疏松癥模型大鼠紅細(xì)胞膜PKC的活性明顯降低，經(jīng)密骨靈治療組模型大鼠與正常組接近［3］。2003年谷野等進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明，含密骨顆粒劑的血清可使UMR106成骨樣細(xì)胞中PKC活性增強(qiáng)，且主要以cPKCβ為主，并能促進(jìn)成骨樣細(xì)胞的增殖。成骨細(xì)胞是骨代謝過程中的重要細(xì)胞，它的增殖有利于骨的形成［4］。

4.4 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的討論

與正常組比較，模型組大鼠腎組織PKCα、β2蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，表明腎組織中PKC蛋白表達(dá)的變化與腎虛骨質(zhì)疏松癥的病理機(jī)制密切相關(guān)。腎組織中PKCα、β2蛋白表達(dá)降低，是腎虛骨質(zhì)疏松癥的病理機(jī)制之一，也是腎虛的病理機(jī)制之一。

補(bǔ)腎中藥(低劑量)、補(bǔ)腎中藥(高劑量)能夠顯著上調(diào)腎虛骨質(zhì)疏松癥模型大鼠腎組織 PKCα、PKCβ2蛋白表達(dá)(P＜0.01)，補(bǔ)脾中藥、蓋天力能夠提高腎虛骨質(zhì)疏松癥模型大鼠腎組織PKCα蛋白表達(dá)(P＜0.05)，但對(duì)于 PKCβ2蛋白表達(dá)的升高無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明以上幾種藥物均有一定的療效，但補(bǔ)腎中藥效果優(yōu)于其他幾種對(duì)照藥，說明補(bǔ)腎中藥可以通過上調(diào)腎虛骨質(zhì)疏松癥模型大鼠腎組織PKCα、PKCβ2蛋白表達(dá)而起到調(diào)整腎虛骨質(zhì)疏松癥的作用。

在本次實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)腎中藥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近正常組，其它用藥組與正常組存在顯著差異，補(bǔ)腎中藥防治骨質(zhì)疏松的效果優(yōu)于健脾中藥等其他各組藥物，一方面說明補(bǔ)腎中藥的有效性，另一方面根據(jù)中醫(yī)以藥驗(yàn)證的理論說明本實(shí)驗(yàn)骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型屬腎虛證。

［1］劉忠厚.骨質(zhì)疏松學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，1998:142.

［2］陳敏，唐建武.PKC亞型的生物學(xué)特性與調(diào)節(jié)功能［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)·生理病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2002，22(5):493-496.

［3］谷野，鄭洪新.含密骨顆粒劑血清對(duì) UMR106成骨樣細(xì)胞增殖及 PKC活性的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2003，30(7):575-577.

［4］崔家鵬，鄭洪新，劉景峰，等.補(bǔ)腎中藥對(duì)腎虛骨質(zhì)疏松癥大鼠紅細(xì)胞膜PKC、Ca2+-Mg2+ATP酶活性影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，1997，3(3):66-69.