周晟芳，李 艷，劉梅潔，李亞楠，付小衛(wèi)，潘靜華，劉 紅，王少君，于 崢，王 瑩，宋長恒，李鴻泓，張治國，鞠大宏△

(1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;2.浙江中醫(yī)藥大學，杭州 310053)

從中醫(yī)角度來看，中醫(yī)的“脾”和“腎”與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)，脾腎虛弱是導致該病發(fā)生的主要原因之一。無比山藥丸出自《太平惠民和劑局方》，具有健脾補腎的功效，是治療脾腎虛弱的經(jīng)典方劑。基于此，本實驗以卵巢切除大鼠為動物模型，采用骨組織形態(tài)計量學的方法，探討該方對骨質(zhì)疏松癥的預防作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用雌性SD大鼠77只，SPF級，體重190g～220g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供(許可證號 SCXK(軍)2007-004)。大鼠在中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級實驗動物室內(nèi)飼養(yǎng)(實驗動物室許可證號SYXK(京)-2010-0032)，適應性喂養(yǎng)10d后開始實驗。

1.1.2 藥物 無比山藥丸方組成:山茱萸9g，澤瀉 12g，熟地 12g，茯苓 9g，巴戟天 6g，牛膝 9g，赤石脂 6g，山藥 15g，杜仲 9g，肉蓯蓉 9g，菟絲子 12g，五味子9g。常規(guī)水煎劑，生藥含量分別為1g/ml、2g/ml。鹽酸雷洛昔芬片(商品名:易維特):LILLY，S.A(西班牙)生產(chǎn)，禮來蘇州制藥有限公司分包裝(產(chǎn)品批號 A611193，分包裝批號 L00835，規(guī)格:60mg/片)，使用時將其碾碎，用蒸餾水配制成濃度為0.5mg/ml的混懸液。

1.1.3 主要儀器 Reicheit-Jung2040切片機、CTR6000顯微鏡、Qwin V3圖像分析儀系統(tǒng)均為德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 先將77只大鼠隨機分為3組，其中空白對照組12只，假手術(shù)組12只，造模組53只。造模組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后，摘除雙側(cè)卵巢［1］，假手術(shù)組只摘取卵巢周圍的少許脂肪組織。術(shù)后15d，再將造模組大鼠按體重隨機分為4組，其中模型組13只，雷洛昔芬組13只，無比山藥丸高劑量組14只，無比山藥丸低劑量組13只。然后開始灌胃給藥，無比山藥丸高劑量組20g生藥/kg體重，低劑量組10g生藥/kg體重，給藥濃度分別為2g生藥/ml、1g生藥/ml;雷洛昔芬組5mg/kg體重，給藥濃度分別為 0.5mg/ml。給藥體積均為1ml/100g體重。以上給藥，1次/d，連續(xù)6d，休息1d后再連續(xù)灌服6d，如此給藥3個月?？瞻讓φ战M、假手術(shù)組、模型組按上法灌服等體積的純凈水。分別在大鼠處死前15d和前3d腹腔注射鹽酸四環(huán)素30mg/kg體重，以對骨進行熒光標記。

給藥結(jié)束后，將大鼠以45mg/kg體重劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將各組大鼠迅速斷頭處死，取右側(cè)脛骨，用4%多聚甲醛溶液固定，制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態(tài)計量學檢測。

1.2.2 指標檢測 取右側(cè)脛骨近端1/3，去除其周圍附著的軟組織，采用塑料包埋法，在Reicheit-Jung2040切片機上，用鎢鋼刀切出縱向不脫鈣骨切片;其中1張切片進行甲苯胺藍染色，另1張切片則直接用于熒光觀察。采用Qwin V3圖像分析系統(tǒng)，按照章明放等人的方法進行骨組織形態(tài)計量［2］。

(1)骨小梁組織形態(tài)計量:骨小梁體積百分比(TBV%):骨小梁體積占被測骨髓腔總體積的百分比，是衡量骨量水平的主要標志;骨小梁吸收表面百分比(TRS%):不規(guī)則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷破骨細胞(OC)的活性;骨小梁形成表面百分比(TFS%):有成骨細胞(OB)被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比，它可判斷OB的活性;骨小梁礦化率(MAR):骨小梁表面熒光雙標記帶的平均距離除以2次標記相隔的天數(shù);(2)皮質(zhì)內(nèi)表面形態(tài)計量:類骨質(zhì)平均寬度(OSW):皮質(zhì)內(nèi)表面有OB被覆的類骨質(zhì)的平均寬度;骨皮質(zhì)礦化率(mAR):皮質(zhì)內(nèi)表面雙標記帶的平均距離除以2次標記相隔的天數(shù)。

1.2.3 統(tǒng)計學處理方法 所得實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 無比山藥丸對去卵巢大鼠脛骨TBV%的影響

表1顯示，模型組及各給藥組大鼠脛骨TBV%較假手術(shù)組顯著降低。與模型組比較，無比山藥丸高、低劑量組TBV%顯著升高，無比山藥丸高、低劑量組之間比較無顯著性差異。陽性對照(雷洛昔芬)組的TBV%顯著高于模型組。

表1 各組大鼠脛骨TBV%的變化

2.2 無比山藥丸對去卵巢大鼠脛骨TRS%的影響

表2顯示，模型組、無比山藥丸高、低劑量組和雷洛昔芬組與假手術(shù)組比較，骨吸收參數(shù)TRS%顯著升高;而與模型組比較，無比山藥丸高、低劑量組和雷洛昔芬組的TRS%皆顯著降低。

表2 各組大鼠脛骨TRS%的變化

2.3 無比山藥丸對去卵巢大鼠脛骨TFS%和MAR的影響

表3顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、無比山藥丸高、低劑量組和雷洛昔芬組大鼠脛骨TFS%和MAR明顯升高，而無比山藥丸高、低劑量組和雷洛昔芬組的TFS%和MAR均低于模型組。

表3 各組大鼠脛骨TFS%的變化

2.4 無比山藥丸對去卵巢大鼠脛骨mAR和OSW的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠脛骨的 mAR和OSW均明顯增高。無比山藥丸高劑量組mAR與模型組相比明顯降低，OSW無顯著性差異;無比山藥丸低劑量組mAR和OSW與模型組相比皆無顯著性差異。雷洛昔芬組的 mAR和OSW與模型組比較顯著降低，與假手術(shù)組相比無顯著差異。

表4 各組大鼠脛骨mAR和OSW的變化

假手術(shù)組的上述指標與空白對照組相比，均無顯著性差異，從而排除了手術(shù)因素對實驗結(jié)果的影響。

3 討論

本實驗采用骨組織形態(tài)計量學方法對各組大鼠脛骨不脫鈣骨切片進行了形態(tài)計量。結(jié)果顯示，摘除大鼠卵巢3個月后，作為衡量骨量多少的重要指標TBV%顯著降低，而衡量骨吸收的指標TRS%以及衡量骨形成的指標TFS%、MAR、mAR和OSW皆顯著增高，說明摘除卵巢所建立的骨質(zhì)疏松癥模型屬于高轉(zhuǎn)換型，即摘除卵巢可使骨吸收與骨形成均增加，但由于骨吸收大于骨形成，從而導致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，這與人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生相一致。給大鼠灌服無比山藥丸后，除高劑量的OSW以及低劑量的mAR、OSW外，均可使上述指標發(fā)生一定程度的逆轉(zhuǎn)。這一結(jié)果表明，無比山藥丸對去卵巢所致的骨質(zhì)疏松癥有一定的預防作用。無比山藥丸之所以能產(chǎn)生這樣的作用，從中醫(yī)學角度來看，主要是由于其具有健脾補腎的功效。如《太平惠民和劑局方》中載其“治丈夫諸虛百損，五勞七傷……或冷痹骨疼，腰髖不隨，飲食雖多，不生肌肉……此藥能補經(jīng)脈……厚腸胃，強筋練骨?！?/p>

中醫(yī)理論認為，腎藏精主骨生髓，腎精充實，則骨骼堅固有力，正如《醫(yī)經(jīng)精義》所云:“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之合也。髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強?！比裟I精虧虛，骨髓化生乏源，骨失其養(yǎng)，則骨脆易折，也就會導致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。腎為先天之本，脾為后天之本，腎精的充實有賴于脾運化的水谷精微來滋養(yǎng)和補充;若脾失運化，水谷精微等營養(yǎng)物質(zhì)不能正常生成和輸布，則腎精乏源而致腎精虧虛，進而導致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。由上觀之，中醫(yī)的“脾”、“腎”在維持骨代謝方面發(fā)揮著重要作用，脾腎虛弱是導致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要原因之一。本研究從實驗角度為這一認識提供了進一步的科學依據(jù)。

［1］鞠大宏，張春英，王安民，等.溫補腎陽方對去卵巢所致骨質(zhì)疏松癥大鼠 IL-1和 IL-6活性的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2000，6(4):29-32.

［2］章明放，張乃鑫，譚郁彬.運動對雌性大鼠去勢后骨質(zhì)疏松癥的作用［J］.中華骨科雜志，1994，14(6):365-369.