張會欣，王宏濤，趙韶華，朱慧明，崔慶飛，齊曉琳

(1.河北以嶺醫(yī)藥研究院藥理室，石家莊 050035;2.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，石家莊 050035)

糖尿病視網(wǎng)膜病(DR)發(fā)病原因錯綜復雜，其具體機制仍不清楚，亦無療效理想的品種出現(xiàn)。大量研究表明，高糖引起的氧化應(yīng)激可能是造成視網(wǎng)膜損傷的主要原因之一［1］。芪黃明目膠囊在治療DR臨床II期實驗中顯示了很好的效果［2］，我們以自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠為模型，從氧化應(yīng)激角度研究芪黃明目對DR的保護作用及其對絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的調(diào)控作用，探討芪黃明目的抗氧化作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 KK/Upj-Ay小鼠40只，30g～40g;C57BL/6雄性小鼠 10只，25g～30g，均為 SPF級，12周齡(購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號0225144)。

1.1.2 試劑與儀器 芪黃明目膠囊，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒購自南京建成生物研究所;p38絲裂原活化激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、磷酸化 ERK(p-ERK)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司。凝膠成像分析儀，Biorad。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥 40只KK/Upj-Ay小鼠按空腹血糖值(FBG)分為模型組、芪黃明目高、中、低劑量組，另設(shè)C57BL/6小鼠為對照組，每組10只動物。采用灌胃給藥，芪黃明目高、中、低劑量組分別給予8.32、4.16、2.08 g生藥/kg的芪黃明目膠囊，對照組和模型組給予等體積的蒸餾水，每日1次，連續(xù)3個月。

1.2.2 一般觀察 給藥期間觀察小鼠全身一般情況，每周1次測定體重、攝食、攝水、尿量，每月測定1次 FBG。

1.2.3 氧化指標的測定 取血并按說明書比色法測定SOD、GSH-Px活性和 CAT、MDA含量。

1.2.4 形態(tài)學變化 取小鼠眼球置于甲醛固定，HE染色;小鼠眼球置于戊二醛固定，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 Western blot法 檢測 p38MAPK、pp38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK 蛋白的表達。取視網(wǎng)膜組織常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，化學發(fā)光法顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。GAPDH作為內(nèi)參照。用目的蛋白吸光度值/內(nèi)參照吸光度值的比值進行比較。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

表1顯示，模型組小鼠明顯體重減輕，多飲、多食、多尿明顯，芪黃明目能明顯緩解“三多一少”癥狀，對照組飲食正常，體重增長明顯，無上述癥狀出現(xiàn)。模型組FBG明顯高于對照組，芪黃明目組空腹血糖明顯低于模型組，治療8周后中、高劑組即有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表1芪黃明目對DR小鼠FBG的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與對照組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組別FBG藥前 第4周 第8周 第12周對 照 組5.99±1.33 4.98±0.89 5.97±1.01 6.12±0.98模 型 組 12.59±2.68△△ 11.92±2.84△△ 12.57±3.51△△ 11.47±2.89△△芪 黃 明 目 低 劑 組 11.95±2.67 11.08±2.41 10.37±2.13 9.12±2.16芪 黃 明 目 中 劑 組 11.57±2.58 10.39±3.24 9.54±2.61* 8.56±1.97*芪 黃 明 目 高 劑 組 12.92±3.04 10.68±2.95 8.63±1.89＊＊ 7.81±1.78＊＊

2.2 氧化指標的變化

表2顯示，模型組小鼠較對照組 SOD、GSH-Px、CAT活性均明顯下降(P＜0.01)，MDA含量明顯升高(P＜0.01)，與模型組比較，芪黃明目低劑組SOD活性上升(P＜0.01)，中劑組 SOD、GSH-Px活性上升(P＜0.01，P＜0.05)，MDA 含量降低(P＜0.05)，高劑組 SOD、GSH-Px、CAT活性均上升(P＜0.01，P＜0.05)，MDA 含量降低(P＜0.01)。

表2芪黃明目對DR小鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量的影響(±s，n=10)

表2芪黃明目對DR小鼠血清SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與對照組比較:△△P＜0.01

組別 SOD(U·ml－1) GSH-Px(U·ml－1) CAT(U·g－1) MDA(nmol·ml－1)對 照 組 80.34±12.39 91.68±20.39 219.95±32.86 5.59±1.84模 型 組 44.61±10.56△△ 45.62±10.69△△ 117.28±25.64△△ 12.68±3.86△△GHMM 低 劑 組 60.25±11.27＊＊ 59.64±12.54 140.69±31.55 10.15±2.19 GHMM 中 劑 組 69.46±13.56＊＊ 65.59±21.14* 132.56±29.68 9.32±2.14*GHMM 高 劑 組 65.56±11.22＊＊ 73.25±19.79＊＊ 150.16±34.21* 8.35±2.63＊＊

2.3 形態(tài)學觀察

圖1顯示，HE染色顯示對照組視網(wǎng)膜各層細胞層次分明，細胞結(jié)構(gòu)緊密;模型組視網(wǎng)膜色素上皮層明顯變薄，細胞排列紊亂，芪黃明目能改善上述變化。電鏡顯示，對照組小鼠視網(wǎng)膜細胞排列整齊，細胞核和細胞器正常;模型組視網(wǎng)膜出現(xiàn)空泡變性，細胞內(nèi)線粒體腫脹，基底膜增厚，芪黃明目治療后細胞腫脹及基底膜增厚皆有明顯減輕，高劑量組最為明顯。

2.4 Western blot檢測DR小鼠視網(wǎng)膜MAPK磷酸化

圖1 小鼠視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察結(jié)果(×5000)

表3圖2顯示，模型組p38MAPK蛋白磷酸化水平明顯高于對照組，芪黃明目組p38MAPK蛋白磷酸化明顯低于模型組(P＜0.01);模型組 JNK和ERK蛋白磷酸化水平明顯高于對照組(P＜0.01)，芪黃明目組蛋白磷酸化與模型組比較無顯著差異;p38MAPK、JNK、ERK蛋白在各組表達無統(tǒng)計意義。

表3芪黃明目對DR小鼠視網(wǎng)膜MAPK磷酸化的影響(±s，n=3)

表3芪黃明目對DR小鼠視網(wǎng)膜MAPK磷酸化的影響(±s，n=3)

注:與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別p38MAPK p-p38MAPK JNK p-JNK ERK p-ERK對 照 組 0.74±0.18 0.29±0.07 0.58±0.14 0.34±0.06 0.3 0.52±0.07 0.82±0.19 0.39±0.11 0.59±0.14 7±0.12 0.24±0.06模 型 組 0.76±0.19 0.69±0.11＊＊ 0.53±0.13 0.86±0.19* 0.39±0.09 0.59±0.12*芪黃明目低劑組 0.72±0.14 0.59±0.09 0.57±0.09 0.87±0.13 0.35±0.08 0.61±0.15芪黃明目中劑組 0.81±0.22 0.42±0.07* 0.49±0.11 0.84±0.16 0.31±0.06 0.57±0.12芪黃明目高劑組 0.85±0.19 0.38±0.08*

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜MAPK Western blot結(jié)果

3 討論

芪黃明目膠囊是針對DR脈絡(luò)瘀阻、絡(luò)虛不榮、脈絡(luò)絀急、熱毒滯絡(luò)等病理變化，采用化瘀通絡(luò)為前提，配合滋潤通補、補氣通絡(luò)、息風解痙、解毒通絡(luò)諸法，從脈絡(luò)論治DR的復方中藥。芪黃明目膠囊由赤芍、黃芪、生地、決明子等藥物組成，具有化瘀通絡(luò)、益氣養(yǎng)陰、止血明目之功效，用于治療糖尿病視網(wǎng)膜病變，證屬血瘀絡(luò)阻、氣陰兩虛型，癥見視物昏花、目睛干澀、面色晦暗、肢體麻木、倦怠乏力、氣短懶言、五心煩熱、口干咽燥、大便干結(jié)等。臨床初步試驗證實，芪黃明目膠囊治療DR安全有效［2］。

高血糖是DM發(fā)生慢性并發(fā)癥的根本原因，芪黃明目膠囊能降低自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠的血糖，增加體重，明顯緩解KK小鼠“三多一少”癥狀，并有劑量依賴性，表明芪黃明目有降低糖尿病小鼠血糖的作用。光鏡和電鏡結(jié)果顯示，芪黃明目能改善視網(wǎng)膜病理損傷，從形態(tài)學上證實了芪黃明目對DR的確有保護作用，延緩糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的發(fā)展，可能與降低血糖有關(guān)。

機體內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生主要源于自由基產(chǎn)生增多和(或)抗氧化防御功能損害。Brownlee博士［3］認為，糖尿病時高濃度的血糖水平抑制了線粒體電子轉(zhuǎn)移鏈，當末尾環(huán)節(jié)受抑時氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生發(fā)展，導致超氧化物陰離子的過量產(chǎn)生。DU Y等［4］研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)、體外實驗均可證明，高糖環(huán)境可以導致視網(wǎng)膜組織細胞中自由基產(chǎn)生增多。此外，高血糖時視網(wǎng)膜組織抗氧化系統(tǒng)功能下降也有大量報道［5］。本實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠SOD、GSH-Px、CAT活性下降，MDA含量升高，與上述報道結(jié)果一致。給予芪黃明目治療后，能明顯提高小鼠 SOD、GSH-Px、CAT活性，降低 MDA含量，提示芪黃明目可抑制DR小鼠自由基產(chǎn)生，提高抗氧化功能，降低DR小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)。

最近，在細胞信號通路中起重要作用的蛋白激酶-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)與DR的關(guān)系引起研究者高度關(guān)注。研究表明，糖尿病狀態(tài)下的氧化應(yīng)激可激活MAPK家族，通過一系列反應(yīng)，參與DR的發(fā)生，影響 DR的進程，阻斷 MAPK通路可抑制DR的發(fā)生［6］。MAPK分三大類，即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)和p38MAPK［7］。我們運用 Western blot方法檢測了DR小鼠視網(wǎng)膜 MAPK磷酸化的變化，發(fā)現(xiàn)p38MAPK、JNK、ERK磷酸化均被激活，給予芪黃明目干預，p38MAPK磷酸化水平降低，JNK、ERK磷酸化無明顯變化，表明芪黃明目是通過抑制p38MAPK磷酸化水平而實現(xiàn)其抗氧化應(yīng)激、保護DR視網(wǎng)膜的作用，其詳細機制尚需進一步研究。

［1］薛嘉睿，郎平，吳昌凡.氧化應(yīng)激在糖尿病視網(wǎng)膜病發(fā)病機制中的研究進展［J］.中國臨床藥理學與治療學，2009，14(3):356-360.

［2］吳烈，晏飛，蘇航，等.芪黃明目膠囊治療非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的臨床研究［J］.中國中醫(yī)眼科雜志，2009，19(2):74-78.

［3］Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism ［J］.Diabetes，2005，54(6):1615-1625.

［4］Du Y， Miller CM， Kern TS. Hyperglycemia increases mitochondrial superoxide in retina and retinal cells［J］.Free Radic Biol Med，2003，35(11):1491-1499.

［5］Barot M，Gokulgandhi MR，Mitra AK.Mitochondrial dysfunction in retinal diseases［J］.Curr Eye Res，2011，36(12):1069-1077.

［6］Du Y，Tang J，Li G，et al.Effects of p38 MAPK inhibition on early stages of diabetic retinopathy and sensory nerve function［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51(4):2158-2164.

［7］高懷林，王玲玲，賈振華，等.P38MAPK通路在內(nèi)皮細胞F-actin蛋白表達中的作用及通絡(luò)藥物的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2010，16(9):769-771.