陳丕績(jī)

(深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518081)

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis)主要指由于多種原因引發(fā)的、以單位體積內(nèi)骨組織量減少為主要特點(diǎn)的代謝性骨類疾病[1]，隨著社會(huì)老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率越來(lái)越高，其發(fā)病緩慢，以骨骼疼痛或易于骨折為主要特征，尤以老年人發(fā)病率居高。骨質(zhì)疏松進(jìn)展無(wú)明顯體征，不易被患者發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)無(wú)法治愈，是引發(fā)一系列骨科疾病的主要病因之一，嚴(yán)重影響患者健康和生活質(zhì)量。成骨細(xì)胞目前是骨質(zhì)疏松相關(guān)研究的主要組織平臺(tái)，由于骨質(zhì)疏松從病理學(xué)改變方面研究，是成骨細(xì)胞中的Ⅰ型膠原分泌量明顯減少，使鈣結(jié)節(jié)形成受限，進(jìn)而產(chǎn)生骨質(zhì)的變化[2]。研究表明，鐵過(guò)量或鐵分布錯(cuò)位是造成骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要因素[3]，鐵調(diào)素具有鐵過(guò)量的下調(diào)作用，因而對(duì)成骨細(xì)胞的生物活性可能存在一定的影響作用。本文通過(guò)對(duì)人成骨細(xì)胞株的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探討鐵調(diào)素在人成骨細(xì)胞增殖、凋亡、鈣化方面的作用和影響。

1 資料與方法

1.1 成骨細(xì)胞制備 人成骨細(xì)胞(hFOB1.10)由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)提供，置于5%CO2和34℃環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用DMEM(高糖)：F12=1:1+10%胎牛血清+0.3‰G418(Amersco公司提供)，培養(yǎng)3～4 d，檢測(cè)細(xì)胞密度達(dá)90%后，使用胰蛋白酶消化，再分種于12孔的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板上每孔置入一塊無(wú)水乙醇處理過(guò)的圓形蓋玻片。

1.2 設(shè)備及試劑 鐵調(diào)素由日本Peptide機(jī)構(gòu)生產(chǎn)，MTT溶液由(0.5 g MTT+100 ml磷酸緩沖液(PBS)+0.22μm濾膜過(guò)濾)自行配置，二甲基亞砜(DMSO)由上海青鴻化工有限公司提供，碧云天由BestBuo貝博生物公司提供，蔡司熒光顯微鏡由Carl Zaiss公司生產(chǎn)，流式細(xì)胞儀由Beckman Coulter公司生產(chǎn)。

1.3 分組及檢測(cè)方法

1.3.1 增殖活性 鐵調(diào)素對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響采用MTT法檢測(cè)。取置備好的血清培養(yǎng)液，配置hFOB1.10細(xì)胞為濃度2×104個(gè)/m細(xì)胞懸液，取96孔培養(yǎng)板接種，每孔100μl，于34℃、飽和濕度、15%CO2環(huán)境下培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液后，取18孔分為三組，100 nmol/L組、200 nmol/L組和對(duì)照組，各6孔。100 nmol/L組加入100 nmol/L鐵調(diào)素，200 nmol/L組加入200 nmol/L鐵調(diào)素，對(duì)照組不加入鐵調(diào)素。各組均間隔24 h換液，并于培養(yǎng)48 h后用PBS洗滌，再分別加入無(wú)血清培養(yǎng)液200μl及MTT溶液200μl，4 h后吸棄培養(yǎng)液，再于各孔加入DMSO，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀進(jìn)行吸光度OD490檢測(cè)，比較鐵調(diào)素對(duì)成骨細(xì)胞增殖的作用。

1.3.2 凋亡檢測(cè) 取置備好的血清培養(yǎng)液，配置hFOB1.10細(xì)胞為濃度2×105個(gè)/m細(xì)胞懸液，于6孔板接種每孔2 ml，24 h后棄培養(yǎng)基，分100 nmol/L組、200 nmol/L組和對(duì)照組三組，100 nmol/L組加入100 nmol/L鐵調(diào)素、200 nmol/L組加入200 nmol/L鐵調(diào)素，對(duì)照組不加鐵調(diào)素。34℃、飽和濕度、5%CO2環(huán)境下間隔24 h換液，48 h后用胰酶消化，PBS洗滌，碧云天混合于室溫孵育10 min，離心吸棄上清液，冰浴避光10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡率。

1.3.3 鈣化功能 采用鈣結(jié)節(jié)染色法，12孔培養(yǎng)板上分種1×105個(gè)/孔細(xì)胞，間隔24 h行培養(yǎng)基更換，同樣分三組，對(duì)照組加入100μl雙蒸水，100 nmol/L組加入100 nmol/L鐵調(diào)素、200nmol/L組加入200nmol/L鐵調(diào)素。間隔24 h更換培養(yǎng)基，15 d棄培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛行30 min固定，后PBS洗滌2～3次，加入5%硝酸銀，置于陽(yáng)光下暴曬30 min，再次PBS洗滌，加入5%硫代硫酸鈉靜置2 min，PBS再次漂洗2～3次，1%中性紅復(fù)染，10 min后PBS洗滌兩次，于光學(xué)顯微鏡下對(duì)各組鈣結(jié)節(jié)形成情況進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，F(xiàn)檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成骨細(xì)胞增殖活性 MTT法檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表1，三組成骨細(xì)胞增殖活性接近，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.38，P＞0.05)。

2.2 成骨細(xì)胞凋亡檢測(cè) 隨著鐵調(diào)素劑量的減少，成骨細(xì)胞凋亡率逐漸增高，數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.28，P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成 利用鐵調(diào)素分組實(shí)驗(yàn)15 d后，染色的三組經(jīng)觀察可見(jiàn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化鈣結(jié)節(jié)形成，利用光學(xué)顯微鏡觀察，鈣化灶呈黑色，散點(diǎn)狀分布且不均勻。采用顯微鏡標(biāo)尺和培養(yǎng)板密度共同測(cè)量成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表1，隨著鐵調(diào)素干預(yù)的減少，鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)呈下降趨勢(shì)，三組成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.28，P＜0.01)。

表1 三組細(xì)胞增殖活性、凋亡檢測(cè)及鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)比較（±s）

表1 三組細(xì)胞增殖活性、凋亡檢測(cè)及鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)比較（±s）

組別200 nmol/L組100 nmol/L組對(duì)照組成骨細(xì)胞增殖活性(nmonl/L)0.74±0.140.72±0.230.73±0.09成骨細(xì)胞凋亡率(%)2.38±0.334.96±0.417.32±0.32成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)(個(gè))287±15145±945±6

3 討論

鐵調(diào)素又被稱為“肝臟抗菌多肽”，21世紀(jì)初才經(jīng)由兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室分別從人類血清及尿液中提取而成[3]。研究表明鐵調(diào)素對(duì)于人體內(nèi)鐵元素狀態(tài)的調(diào)節(jié)以及腸道內(nèi)鐵吸收的活性有著十分關(guān)鍵的作用[4]。鐵元素廣泛的參與到人體肌紅蛋白、血紅蛋白的合成當(dāng)中，是細(xì)胞色素氧化酶的組成成分，對(duì)線粒體電子傳遞有參與作用，為三羧酸循環(huán)中的酶及其他因子提供有效的鐵環(huán)境，對(duì)人體的代謝及呼吸功能有很大的影響效應(yīng)[5]。近些年來(lái)，隨著骨科病理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原的分泌減少和鈣結(jié)節(jié)的形成減少是骨質(zhì)疏松的主要成因，在骨重建系統(tǒng)中，成骨細(xì)胞的激活對(duì)于鐵元素具有很強(qiáng)的敏感性，但巨噬細(xì)胞分化形成的破骨細(xì)胞，卻能夠在大量的鐵沉積環(huán)境下正常生長(zhǎng)，促使鐵過(guò)量或鐵分布錯(cuò)位成為骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要誘發(fā)因素[6]。因而，鐵調(diào)素對(duì)鐵過(guò)量或鐵分布錯(cuò)位的有效調(diào)節(jié)可能為成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)提供良好的體內(nèi)環(huán)境，對(duì)骨質(zhì)疏松有較好的病理學(xué)改善作用。

張鵬等[7]針對(duì)鐵動(dòng)態(tài)平衡改變對(duì)骨代謝的影響做了實(shí)驗(yàn)性研究，結(jié)果表明不同鐵調(diào)素的干預(yù)可引起鈣離子不同熒光強(qiáng)度的反應(yīng)，隨著hFOB1.10外鐵調(diào)素濃度的增加，鈣離子更大量的向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，而hFOB1.10外鐵離子濃度的下降能夠促進(jìn)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，說(shuō)明通過(guò)鐵調(diào)素降低鐵離子的含量，可促進(jìn)成骨細(xì)胞對(duì)鈣的吸收。劉樹欣等[8]的報(bào)道則對(duì)細(xì)胞鐵代謝相關(guān)性的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述與總結(jié)，文章指出，鐵調(diào)素已被證實(shí)對(duì)于十二指腸的鐵吸收、控制組織細(xì)胞內(nèi)的鐵穩(wěn)定和促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)的鐵釋放有較好作用。趙東陽(yáng)等[9]的研究提示鐵調(diào)素的干預(yù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量有明顯影響，且其影響在0～100 nmol/L的范圍內(nèi)有明顯的劑量依賴性。

本研究主要從骨科角度對(duì)鐵調(diào)素與成骨細(xì)胞相關(guān)性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，并細(xì)致的將成骨細(xì)胞化分為增殖、凋亡、鈣化三個(gè)階段，結(jié)果表明，鐵調(diào)素的干預(yù)對(duì)于成骨的增殖無(wú)顯著影響，但對(duì)其凋亡和鈣化作用明顯。隨著鐵調(diào)素用量的增加，成骨細(xì)胞凋亡率明顯降低，而鈣化計(jì)數(shù)明顯增高，提示鐵調(diào)素對(duì)于促進(jìn)骨質(zhì)內(nèi)部的鈣吸收、減少骨細(xì)胞損傷和凋亡具有重要的促進(jìn)作用。骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為嚴(yán)重危害老年人健康與生活質(zhì)量的常見(jiàn)疾病[10]，由于其發(fā)展緩慢，不易迅速表現(xiàn)為明顯的體征而被患者關(guān)注。臨床對(duì)骨質(zhì)疏松的治療應(yīng)從病理學(xué)角度增強(qiáng)患者的骨能量，促進(jìn)骨鈣的吸收，使骨密度逐漸提升并獲得較好的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)作用。鈣化能力的增強(qiáng)及凋亡的減少，是成骨細(xì)胞生長(zhǎng)和改善患者骨質(zhì)狀況的必要條件，從而減輕老年骨質(zhì)疏松患者的痛苦，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)壽命?？傊?，鐵調(diào)素對(duì)于成骨細(xì)胞有著較好的促生長(zhǎng)作用，能夠有效調(diào)節(jié)人體內(nèi)鐵元素環(huán)境，對(duì)于進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松的防治具有重要參考價(jià)值。

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