吳愛(ài)萍 代 蓉 李相融 王 輝 薛 靜 張 超 淤澤溥

(云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

傣醫(yī)認(rèn)為“雅解(解藥)”能調(diào)節(jié)人體生理功能、解除人體的各種毒素，保持體內(nèi)“四塔五蘊(yùn)”功能的平衡和協(xié)調(diào)。“雅解”方藥在疾病的防治中發(fā)揮重要的作用，臨床應(yīng)用十分廣泛。課題組前期實(shí)地調(diào)研、收集、整理及西雙版納州傣醫(yī)院等單位進(jìn)行的初步臨床研究結(jié)果表明，多種傣醫(yī)解藥具有一定的保肝作用，對(duì)肝病、消化系統(tǒng)疾病、代謝性疾病等均有肯定的療效。我們選用有長(zhǎng)期臨床應(yīng)用基礎(chǔ)的“雅解”方中的代表方——西雙版納州傣醫(yī)院的院內(nèi)制劑“雅解沙把”進(jìn)行保肝作用的研究。

減少毒物對(duì)機(jī)體的損傷可能是解藥“雅解沙把”解毒的作用機(jī)制之一，肝臟是體內(nèi)血流最豐富的器官，也最容易受到毒物的損傷。本實(shí)驗(yàn)在傣醫(yī)基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)下，對(duì)通過(guò)研究“雅解沙把”對(duì)小鼠急性化學(xué)性肝損傷模型血清轉(zhuǎn)氨酶的影響，為其臨床用于防治肝損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步研究其“解毒”作用機(jī)制的特點(diǎn)提供理論支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 動(dòng)物:昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌雄兼用，體重18～22g。均購(gòu)自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，許可證號(hào):SCXK(川)2008－24。

1．2 藥物:“雅解沙把”(百解膠囊)，滇藥制字(Z)20082252K，0．2g×60 粒/瓶，5 粒/次，每日 次;由西雙版納州傣醫(yī)院提供。聯(lián)苯雙酯滴丸:國(guó)藥準(zhǔn)字H33020232，1．5mg×250丸/瓶，5粒/次，每日3次;浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào):100409、101004。茵梔黃口服液:北京雙鶴高科天然藥物有限責(zé)任公司，批號(hào):272421。

1．3 試劑:四氯化碳(CCl4):分析純，≥99．5%，武漢聯(lián)堿廠，批號(hào):20040310。D－氨基半乳糖(D－Galn):≥99%，為sigma公司產(chǎn)品。對(duì)乙酰氨基酚(AAP):瑞士admas公司產(chǎn)品，批號(hào):T03171。硫代乙酰胺(TAA):瑞士admas公司，批號(hào):T3533。α－萘異硫氰酸酯(ANIT):acros公司，批號(hào):A0298308。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒，批號(hào):20110228、20110624、20111031;天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒，批號(hào):20110620、20111101;總膽紅素(Tbil)測(cè)定試劑盒，批號(hào):20111111;以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1．4 儀器:Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀:瑞士Tecan公司;UV－N2550紫外分光光度計(jì):日本島津公司;CF16 RXⅡseries冷凍離心機(jī):日本HITACHI公司;XS125A電子分析天平:瑞士Precisa公司;UB－7 pH計(jì):;美國(guó)丹佛儀器公司(DENVER INSTRUMENT);HW－80A旋渦混合器:上海精科實(shí)業(yè)有限公司;HH－6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司。

2 方法和結(jié)果

2．1 “雅解沙把”劑量選擇及藥物制備:按人和動(dòng)物的體表面積計(jì)算法，計(jì)算得出“雅解沙把”小鼠口服給藥的等效量為0．39g生藥/kg，再參考前期完成的“雅解沙把”抗炎、解酒等實(shí)驗(yàn)的有效劑量為9倍臨床等效劑量，故本實(shí)驗(yàn)選擇3．51g生藥/kg、0．39g生藥/kg為高、低劑量，此劑量相當(dāng)于臨床用劑量的9倍和1倍。

取“雅解沙把”生藥粉末250g，用無(wú)紡布袋分裝后包煎，第一次加3倍量水煎煮，煮沸計(jì)時(shí)，30min后過(guò)濾;第二次加2倍量水煎煮，煮沸計(jì)時(shí)，20min后過(guò)濾;第3次加2倍量水煎煮，煮沸計(jì)時(shí)，20min后過(guò)濾。將三次濾液合并，濃縮成稠浸膏，置冰箱中冷藏保存?zhèn)溆?，臨用前按劑量現(xiàn)配至所需濃度。

2．2 “雅解沙把”對(duì)CCl4致急性肝損傷模型小鼠血清ALT的影響:參考文獻(xiàn)［1］方法，取雄性昆明種清潔級(jí)小鼠75只，按體重與性別隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、雅解沙把高、低劑量組，每組動(dòng)物15只。按分組分別等體積灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組給予等體積1%CMC －Na，1次/d，連續(xù)用藥6d，第6 日給藥后30min，除正常對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射0．2%的CCl4橄欖油溶液0．1ml/10g．bw，造模后禁食不禁水20h，第7日再給藥一次，末次給藥后30min，摘眼球取血，以r/min離心15min，分離血清，按試劑盒(賴氏法)操作方法測(cè)定血清ALT。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，“雅解沙把”高劑量組小鼠血清ALT低于CCl4致肝損傷模型組 (P ＜0．01)，低劑量組有作用趨勢(shì)(P ＞0．05)。

表1 “雅解沙把”對(duì)CCl4致急性肝損傷模型小鼠血清ALT的影響(+s)

表1 “雅解沙把”對(duì)CCl4致急性肝損傷模型小鼠血清ALT的影響(+s)

注:與正常組相比:0△△P ＜0．01;與模型組相比，＊＊P ＜0．01

分組 劑量(/kg) 動(dòng)物數(shù)(只) ALT(IU/L)正常20ml 15 15．09 ±3．70模型 20ml 12 148．25 ±28．52△△聯(lián)苯雙酯 200mg 14 100．46 ±34．30＊＊雅解高 3．51g 15 100．36 ±37．42＊＊雅解低0．39g 14 113．05 ±40．88

2．3 “雅解沙把”對(duì)D－Galn致急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST的影響:參考文獻(xiàn)［2，3］方法，取昆明種清潔級(jí)小鼠70只，雌雄各半，分組給藥同2．2。不同者為每組動(dòng)物14只，正常組和模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)用藥7d。末次給藥1h后，除正常組腹腔注射等量生理鹽水(NS)外，其余4組分別按0．08ml/10g．bw腹腔注射800mg/kg DGaln，給藥后24h，摘眼球取血，分離血清，按試劑盒(賴氏法)操作方法分別測(cè)定ALT、AST。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，“雅解沙把”高劑量組小鼠血清ALT低于D－Galn肝損傷模型組(P＜0．05)，而對(duì)抑制AST的升高僅有作用趨勢(shì)(P ＞0．05)。

表2 “雅解沙把”對(duì)D－Galn致肝損傷模型小鼠血清ALT、AST的影響(+s)

表2 “雅解沙把”對(duì)D－Galn致肝損傷模型小鼠血清ALT、AST的影響(+s)

注:與正常組相比:△△P ＜0．01;與模型組相比:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

分組 劑量(/kg) 動(dòng)物數(shù)(只) ALT(IU/L) AST(IU/L)正常20ml 12 8．57 ±2．61 9．51 ±1．87模型 20ml 13 58．48±33．71△△ 32．60±19．54△△聯(lián)苯雙酯 200mg 13 15．33±11．68＊＊ 13．17±3．89＊＊雅解高 3．51g 12 24．97 ±14．60* 19．57 ±10．47雅解低0．39g 12 56．93 ±26．34 28．77 ±17．23

2．4 “雅解沙把”對(duì)AAP致急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST的影響:參考文獻(xiàn)［4，5］方法，取昆明種清潔級(jí)小鼠80只，雌雄各半，分組給藥同2．3。不同者為每組動(dòng)物16只，除正常對(duì)照組外，其余4組分別灌胃給予500mg/kg AAP，給藥24h后，按前述方法測(cè)定ALT、AST。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，“雅解沙把”高劑量組小鼠血清ALT低于AAP致肝損傷模型組(P＜0．05)，而對(duì)抑制AST的升高有作用趨勢(shì)(P ＞0．05)。

表3 “雅解沙把”對(duì)AAP致急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST的影響(—χ+s)

2．5 “雅解沙把”對(duì)TAA致急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST的影響:參考文獻(xiàn)［6－8］方法，取昆明種清潔級(jí)小鼠70只，雌雄各半，分組給藥同2．3。不同者為，除正常組腹腔注射等量NS外，其余4組分別腹腔注射100mg/kg－TAA溶液，給藥16h后(禁食不禁水)，按前述方法測(cè)定ALT、AST。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，“雅解沙把”高劑量組對(duì)降低TAA致小鼠血清ALT的升高有作用趨勢(shì)(P＞0．05)。

表4 “雅解沙把”對(duì)TAA致急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST的影響(+s)

表4 “雅解沙把”對(duì)TAA致急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST的影響(+s)

注:與正常組相比:△△P ＜0．01;與模型組相比:*P ＜0．05

分組 劑量(/kg) 動(dòng)物數(shù)(只) ALT(IU/L) AST(IU/L)正常20ml 13 10．41 ±4．67 15．01 ±3．28模型 20ml 12 113．47±39．08△△ 77．41±15．09△△聯(lián)苯雙酯 300mg 12 69．03 ±35．09* 60．65 ±20．55*雅解高 3．51g 13 86．30 ±22．99 72．31 ±16．42雅解低0．39g 13 114．58 ±33．88 78．15 ±27．15

2．6 “雅解沙把”對(duì) ANIT致急性肝損傷模型小鼠血清ALT、AST的影響:參考文獻(xiàn)［8－10］方法，取昆明種清潔級(jí)小鼠84只，雌雄各半，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、茵梔黃組、雅解沙把高、低劑量組，每組動(dòng)物14只。除正常組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水外，其余各組按分組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)用藥8d。第6d給藥1h后，除正常組外，其余5組均灌胃給予100mg/kgANIT橄欖油溶液，中毒后繼續(xù)給藥2d。第8d給藥1h后(ANIT中毒48 h)摘眼球取血，分離血清，測(cè)定 ALT、Tbil。所有小鼠在ANIT中毒前和處死前分別禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，“雅解沙把”高劑量組小鼠血清ALT低于ANIT致肝損傷模型組 (P ＜0．05)。

表5 “雅解沙把”對(duì)ANIT致急性肝損傷模型小鼠血清ALT、Tbil的影響(+s)

表5 “雅解沙把”對(duì)ANIT致急性肝損傷模型小鼠血清ALT、Tbil的影響(+s)

注:與正常組相比:△△P ＜0．01;與模型組相比:*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

分組 劑量(/kg) 動(dòng)物數(shù)(只) ALT(IU/L) Tbil(umol/L)正常20ml 14 8．97 ±3．20 4．67 ±3．21模型 20ml 13 80．24±17．45△△ 95．70±18．07△△聯(lián)苯雙酯 200mg 11 42．90±20．63＊＊ 81．76±10．76*茵梔黃 20ml 10 65．77 ±16．16* 80．69 ±12．92*雅解高 3．51g 12 64．55 ±19．18* 83．82 ±14．50雅解低0．39g 10 78．11 ±28．95 95．44 ±19．77

3 討論

CCl4、D－Glan、AAP、TAA和ANIT損傷肝臟的機(jī)理不同。CCl4損傷肝臟的主要機(jī)理是CCl4經(jīng)肝細(xì)胞色素P450代謝激活后生成三氯甲基(CCl3)自由基和氯自由基可引起細(xì)胞膜，脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死，胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶滲入血液［6，11］。D－Glan損傷肝細(xì)胞是由于其與磷酸尿嘧啶核苷競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，導(dǎo)致糖原、RNA、蛋白質(zhì)合成障礙，從而引起肝細(xì)胞炎癥和壞死［6］。過(guò)量的AAP進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)肝細(xì)胞色素P450代謝后，產(chǎn)生大量的半醌自由基，其需要谷胱甘肽(GSH)參與滅活，過(guò)多的自由基使肝內(nèi)GSH被消耗，并與肝細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合;且AAP在肝內(nèi)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，可引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷壞死［11，12］。TAA對(duì)肝臟造成損害，可能是由于TAA經(jīng)肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素P450代謝后的產(chǎn)物與肝臟大分子物質(zhì)結(jié)合，引起肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變繼而壞死［13］。ANIT損傷肝細(xì)胞，不僅引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，致使肝細(xì)胞變性、壞死。而且還直接損傷肝內(nèi)膽管的內(nèi)皮細(xì)胞，使之變性、腫脹、壞死，引起膽管阻塞，導(dǎo)致膽汁外溢，血中膽紅素明顯升高［14］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，“雅解沙把”對(duì)CCl4、D－Glan、AAP、TAA和ANIT所引起的小鼠急性肝損傷均具有一定的保肝降酶作用。此外，項(xiàng)目組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，“雅解沙把”具有一定清除機(jī)體自由基的能力。綜合分析“雅解沙把”對(duì)這5種化學(xué)性肝損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及課題組前期研究結(jié)果，我們認(rèn)為該藥保肝作用的重要機(jī)理可能與其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程、增加機(jī)體清除自由基能力有關(guān)，還可能與其能調(diào)節(jié)肝細(xì)胞核酸、蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)正常代謝有關(guān)。綜上所述，我們認(rèn)為“雅解沙把”并非僅僅作用于其中的某一種環(huán)節(jié)，而是對(duì)多種機(jī)制的多個(gè)環(huán)節(jié)都有影響，從而顯示其多成分、多途徑綜合作用的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于該方保護(hù)肝臟的具體作用機(jī)制的探討有待于進(jìn)一步深入研究。

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