張麗景， 金成艷， 王果元， 吳 博， 李全鳳， 徐長(zhǎng)慶， 田 野， 張 力

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，黑龍江哈爾濱150081)

心肌重塑是伴隨和加重心力衰竭發(fā)展的一個(gè)重要過(guò)程，其中心肌纖維化是心肌重塑的一種形式。在心肌纖維化過(guò)程中，心肌成纖維細(xì)胞增殖，心肌間質(zhì)膠原纖維沉積，心肌僵硬度增加，加重心臟功能障礙。因此揭示心肌成纖維細(xì)胞增殖的影響因素及機(jī)制是阻斷這一過(guò)程的基礎(chǔ)，將為改善心功能提供理論依據(jù)。

心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)是心肌組織中的可分裂細(xì)胞，占心臟細(xì)胞總數(shù)的近70%。以往認(rèn)為，CFs不像心肌細(xì)胞那樣在心臟的功能中起著關(guān)鍵作用，但近年來(lái)的研究越來(lái)越多地集中到CFs上，并發(fā)現(xiàn)其與心肌細(xì)胞相互作用，在心肌細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)中不可或缺［1－2］。導(dǎo)致心肌纖維化的心肌間質(zhì)Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維主要是由CFs分泌的，而CFs被激活成心肌肌成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵體液因子是血管緊張素 II(angiotensinⅡ，AngⅡ)［3］。但Ang II促心肌成纖維細(xì)胞增殖作用的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制不清。而含有Src同源結(jié)構(gòu)域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain－containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP－2)是多種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)共同細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，并在促細(xì)胞增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起正相調(diào)節(jié)作用［4］，因此我們提出假設(shè)，即Ang II對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的作用是通過(guò)SHP－2調(diào)控的。

SHP－2是一種胞內(nèi)型蛋白酪氨酸磷酸酶，含有2個(gè)Src同源結(jié)構(gòu)域，可與磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，并轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，廣泛存在于機(jī)體的各種組織和細(xì)胞中。大量文獻(xiàn)報(bào)道，SHP－2與心臟疾病密切相關(guān)［5－7］。為驗(yàn)證我們的假說(shuō)，我們?cè)谛募〕衫w維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SHP－2，另外采用SHP－2的抑制劑，觀察在血管緊張素Ⅱ作用下SHP－2對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 1～3 d SD大鼠仔鼠，雌雄不限，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心(許可證號(hào)為黑動(dòng)字第80050/009)提供。

1.2 主要試劑 胰蛋白酶、MTT和AngⅡ均購(gòu)自Sigma;DMEM培養(yǎng)基(高糖)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自 HyClone;腺病毒 Ad－GFP、腺病毒野生型和突變型載體 pAd－GFP－SHP－2、pAd－GFP－SHP－2E76A由美國(guó)耶魯大學(xué)Anton M.Bennet教授惠贈(zèng);SHP－2抑制劑NSC－87877購(gòu)自Calbiochem;抗波形蛋白(vimentin)抗體購(gòu)自博士德;免疫組化小鼠二步法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中杉公司。

2 方法

2.1 CFs原代培養(yǎng) 無(wú)菌條件下開(kāi)胸取出仔鼠心臟，剪成4～6塊，加入0.25%胰蛋白酶于37℃消化，所得的全部細(xì)胞用培養(yǎng)液懸浮，分種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)90 min，貼壁細(xì)胞即心肌成纖維細(xì)胞。用完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、青霉素 1×105U/L、鏈霉素 100 mg/L的DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)細(xì)胞2～3 d。當(dāng)融合度達(dá)80%～90%，消化傳代。第2～3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 CFs鑒定 待細(xì)胞鋪滿蓋玻片的50% ～70%時(shí)，PBS洗5 min×3次，用4%多聚甲醛室溫固定30 min。3%過(guò)氧化氫室溫孵育5 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加波形蛋白Ⅰ抗(1∶200)，置4℃冰箱過(guò)夜;次日晨 PBS漂洗，加入Ⅱ抗，室溫靜置30 min;3，3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色1 min，蘇木素復(fù)染。PBS作為陰性對(duì)照。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在60 mm培養(yǎng)皿中按照1.0×105的密度接種細(xì)胞，將重組腺病毒Ad－GFP(GFP組)、野生型Ad－GFP－SHP－2(WT組)、突變型Ad－GFP－SHP－2－E76A(EA組)分別感染心肌成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)4 h后，補(bǔ)加適當(dāng)體積的完全培養(yǎng)基。48 h后通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)情況。

2.4 Western blotting 收集細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞30 min;4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定蛋白含量;加入上樣緩沖液沸水中煮沸5 min，進(jìn)行SDS－PAGE電泳。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜;膜封閉1 h，然后加Ⅰ抗于4℃孵育過(guò)夜。次日晨加Ⅱ抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)在搖床上孵育1 h，然后經(jīng)ECL發(fā)光試劑(Pierce)顯影，最后于暗室X線膠片感光。

2.5 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率 細(xì)胞以1.0×104cells/well的密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁至細(xì)胞融合達(dá)70% ～80%后，換無(wú)血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h。轉(zhuǎn)染48 h、AngⅡ刺激 24 h、NSC－87877作用 24 h后，每孔加入MTT試劑(5 g/L)20 μL避光培養(yǎng)4 h。小心吸棄孔內(nèi)上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL/well，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm吸光度值。細(xì)胞增殖率=(處理組A490/對(duì)照組A490)×100%。

2.6 實(shí)驗(yàn)分組 SHP－2過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖作用分組如下:(1)無(wú)轉(zhuǎn)染對(duì)照組(control組);(2)轉(zhuǎn)染Ad－GFP對(duì)照組(GFP組);(3)轉(zhuǎn)染Ad－GFP－SHP－2野生型組(WT組);(4)轉(zhuǎn)染Ad－GFP－SHP－2－E76A突變體組(EA組);(5)AngⅡ組;(6)GFP+AngⅡ組;(7)WT+AngⅡ組;(8)EA+AngⅡ組。SHP－2抑制劑NSC－87877對(duì)AngⅡ刺激下細(xì)胞增殖作用的分組如下:(1)NSC－87877 0 μmol/L+AngⅡ組;(2)NSC－87877 25 μmol/L+AngⅡ組;(3)NSC－87877 50 μmol/L+AngⅡ組;(4)NSC－87877 75 μmol/L+AngⅡ組(AngⅡ濃度均為 10－7mol/L)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 CFs形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

大部分CFs分離培養(yǎng)90 min后貼壁，呈梭形，分布較均勻，散在生長(zhǎng)。CFs生長(zhǎng)迅速，2～3 d即呈融合狀態(tài)，胞體大，胞質(zhì)透明，細(xì)胞無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)，見(jiàn)圖1A。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，我們所分離的CFs波形蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，即胞質(zhì)內(nèi)有大量棕黃色顆粒沉著，胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕色絲狀或束狀結(jié)構(gòu)，陽(yáng)性率在90%以上，見(jiàn)圖1C。PBS作為陰性對(duì)照，可見(jiàn)清晰的長(zhǎng)梭形細(xì)胞形態(tài)，胞漿和胞核藍(lán)染，對(duì)照呈陰性，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.The morphology and identification of rat neonatal cardiac fibroblasts(×100).A:cardiac fibroblasts were cultured for 2 d and observed under a light microscope;B:negative control of immunochemical staining using PBS;C:the positive cells of vimentin immunochemical staining were more than 90%.Scale bar:10 μm.圖1 心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)及波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色

2 AngⅡ促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖

AngⅡ在無(wú)血清培養(yǎng)下作用24 h。當(dāng)AngⅡ濃度為10－9mol/L時(shí)，細(xì)胞的增殖作用明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系;當(dāng)AngⅡ濃度達(dá)到10－7mol/L時(shí)，細(xì)胞的增殖率達(dá)到最大值(200% ±19%)。當(dāng)繼續(xù)增大AngⅡ濃度到10－6mol/L和10－5mol/L時(shí)，細(xì)胞活力反而降低，增殖率分別是191% ±18%和169% ±12%，但與無(wú)AngⅡ刺激的對(duì)照組相比，依然有明顯的促增殖效果(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。因此，我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用濃度為10－7mol/L的AngⅡ。

3 SHP－2在CFs中的過(guò)表達(dá)

重組腺病毒［8］感染CFs時(shí)，我們優(yōu)化了感染效率。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為100時(shí)，Ad－GFP、Ad－WT和 Ad－EA感染心肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率都可達(dá)到90%左右，見(jiàn)圖3A。

Western blotting結(jié)果顯示，GFP組SHP－2的表達(dá)與對(duì)照組一致，是CFs內(nèi)源性SHP－2的表達(dá);WT組和EA組SHP－2的表達(dá)量明顯增多(P＜0.01)，見(jiàn)圖3B。

Figure 2.AngⅡ promoted cardiac fibroblast proliferation in a dose－dependent manner.±sE.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group(AngⅡ=0 mol/L).圖2 MTT法檢測(cè)AngⅡ促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖

Figure 3.Overexpression of SHP－2 in cardiac fibroblasts by transfection of SHP－2 adenovirus and detection of expression of SHP－2.A:the transfection efficiency after 48 h of transfection(×40)was detected by green fluorescence emitted from the green fluorescent protein under a fluorescence microscope;B:expression of SHP－2 in cardiac fibroblasts.±sE.n=3.＊＊P＜0.01 vs control.圖3 重組腺病毒轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后SHP－2的表達(dá)

4 SHP－2過(guò)表達(dá)增強(qiáng)AngⅡ作用下CFs的增殖

與對(duì)照組相比，沒(méi)有AngⅡ刺激、單純轉(zhuǎn)染組的CFs，即GFP組、WT組和EA組細(xì)胞增殖不明顯(P＞0.05);AngⅡ刺激后，其余各組增殖率明顯增高;AngⅡ組與對(duì)照組以及GFP+AngⅡ組與GFP組相比，細(xì)胞都有明顯增殖(P＜0.01);與轉(zhuǎn)染了空載體的GFP+AngⅡ組相比，轉(zhuǎn)染了SHP－2的WT+AngⅡ組和轉(zhuǎn)染了SHP－2－E76A突變體的EA+AngⅡ組增殖率分別是239% ±29%、279% ±12%，增殖率顯著增加，另外，EA+AngⅡ組增殖率也明顯高于WT+AngⅡ組(P ＜0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.SHP－2 overexpression enhanced cardiac fibroblast proliferation upon AngⅡtreatment.±sE.n=3.△△P＜0.01 vs group 1;▲▲P ＜0.01 vs group 2;*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs group 6;##P＜0.01 vs group 7.圖4 SHP－2過(guò)表達(dá)對(duì)心肌成纖維細(xì)胞活力的影響

5 SHP－2抑制劑NSC－87877降低AngⅡ作用下CFs的增殖

在AngⅡ作用下，當(dāng)抑制劑濃度為25 μmol/L時(shí)抑制細(xì)胞增殖;在濃度達(dá)50 μmol/L時(shí)，增殖率為60% ±8%，明顯降低(P＜0.01);當(dāng)抑制劑濃度增大到75 μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制增殖率為66% ±8%，與50 μmol/L的濃度相比沒(méi)有顯著差異，但與對(duì)照組相比，抑制效果依然明顯(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.SHP－2 inhibitor NSC－87877 attenuated cardiac fibroblast proliferation induced by AngⅡ.±sE.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control group(NSC－87877=0 μmol/L).圖5 SHP－2抑制劑NSC－87877對(duì)細(xì)胞增殖的影響

討 論

心肌纖維化是惡化心力衰竭的一個(gè)過(guò)程。左室重構(gòu)包括心肌重構(gòu)和心肌間質(zhì)重構(gòu)，心肌間質(zhì)重構(gòu)的過(guò)程就是成纖維細(xì)胞過(guò)度增生和心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的過(guò)程［9］。AngⅡ是導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致心臟間質(zhì)纖維化的主要體液因素。AngⅡ可顯著刺激CFs增加DNA合成速率，并可促進(jìn)CFs早期反應(yīng)基因的表達(dá)，加速其增殖［10－11］。為明確細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子SHP－2的作用，我們檢測(cè)了SHP－2在 AngⅡ作用下對(duì)CFs的影響。

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)原代培養(yǎng)，建立CFs的培養(yǎng)體系，并鑒定成纖維細(xì)胞的純度達(dá)到90%以上，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。有實(shí)驗(yàn)表明AngⅡ有促成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成增多等作用［12］。為明確AngⅡ作用的最佳濃度，本研究進(jìn)行了濃度梯度實(shí)驗(yàn)，確定了AngⅡ促增殖的最佳濃度為10－7mol/L。

我們采用重組腺病毒轉(zhuǎn)染方法過(guò)表達(dá)SHP－2，而后檢測(cè)SHP－2過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，SHP－2在AngⅡ作用下可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖。而在無(wú)AngⅡ作用下的SHP－2過(guò)表達(dá)的WT組和EA組，對(duì)細(xì)胞增殖作用不明顯，這與SHP－2在基礎(chǔ)狀態(tài)下，N－SH2結(jié)構(gòu)域與其酶解結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，而使其處于自我抑制狀態(tài)有關(guān)［13］。只有當(dāng)其與磷酸化底物結(jié)合時(shí)，這種自我抑制狀態(tài)才能解除。有研究表明，AngⅡ可以增加AT1受體第319位點(diǎn)酪氨酸的磷酸化，進(jìn)而激活A(yù)T1受體和EGFR之間的信號(hào)通路，文獻(xiàn)推測(cè)SHP－2可以與AT1受體的pTyr－319結(jié)合［14］。由此提示，SHP－2可能是 AngⅡ致CFs增殖的細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵因子。

我們又采用SHP－2抑制劑NSC－87877從反面測(cè)試我們的假設(shè)。結(jié)果顯示，SHP－2抑制劑的加入明顯抑制了AngⅡ刺激的CFs的增殖。雖然當(dāng)NSC－87877濃度達(dá)到75 μmol/L時(shí)，這種抑制作用有所減低，但抑制效果依然顯著，抑制增殖率與50 μmol/L相比，沒(méi)有明顯差異。正如文獻(xiàn)報(bào)道，NSC－87877的最佳作用濃度為50 μmol/L，當(dāng)濃度較高時(shí)，NSC－87877對(duì)SHP－1也有交叉抑制，即其抑制效應(yīng)的特異性將降低［15］。

總之，我們的結(jié)果從一個(gè)側(cè)面提示了AngⅡ作用的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，但更深入的機(jī)制還有待探討。

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