郭寶磊， 楊茂偉， 梁 單， 曹軍軍， 楊 蕾， 郭曉東

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科，遼寧沈陽110001)

骨質(zhì)疏松癥是以骨形成減少、骨量降低為特征的疾病，目前流行病學(xué)調(diào)查表明［1］，糖尿病患者的骨量明顯降低，而骨折的風(fēng)險明顯增加。糖尿病所導(dǎo)致的骨代謝異常主要表現(xiàn)為骨形成缺陷、成骨細胞數(shù)量減少、類骨質(zhì)形成不足等［2］。研究表明高糖可以引起成骨細胞凋亡［3］，但具體機制目前尚未清楚，本文通過高糖處理成骨細胞系MC3T3-E1細胞后，檢測成骨細胞的凋亡情況及細胞內(nèi)ROS水平和游離Ca2+濃度，初步探討高糖誘導(dǎo)成骨細胞凋亡的機制。

材料和方法

1 材料

小鼠MC3T3-E1成骨細胞株購自美國培養(yǎng)物保存中心 (ATCC，CRL-2593)，α-MEM培養(yǎng)基購于Gibco，胎牛血清購于 HyClone，MTT、二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和膜通透性Ca2+螯合劑1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷 -N，N，N'，N'-四乙酸四(乙酰氧甲基)酯［1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N'，N'-tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl)ester，BAPTA-AM］購于 Sigma，D-葡萄糖、甘露醇和氯化鑭購于國藥集團公司，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)購于碧云天公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于北京賽寶克公司，2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)、Fura-2/AM 購于Molecular Probes。

2 細胞培養(yǎng)

小鼠MC3T3-E1細胞培養(yǎng)于含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基當(dāng)中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶常規(guī)傳代。

3 細胞體外生長活性檢測

采用 MTT法進行檢測。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞，以5×107/L密度接種于96孔板當(dāng)中(100 μL/well)，培養(yǎng)24、48 h 后，加入不同濃度D-葡萄糖的α-MEM培養(yǎng)基(100 μL/well)，使D- 葡萄糖終濃度為 0、10、20、30、40、50、60、70、80 mmol/L，重復(fù)設(shè)置6孔。加藥作用24和48 h后棄掉培養(yǎng)基，向每孔分別加入20 μL的5 g/L的MTT儲存液，并于37℃孵育4 h。吸出MTT后，向每孔加入150 μL的DMSO，酶標(biāo)儀570 nm波長測定吸光度。按照抑制率(%)=［A570(正常)-A570(加藥)］/A570(正常)×100%，計算出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

4 實驗分組

取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞隨機分成以下各組:(1)正常對照組(control);(2)高糖組(HG):35 mmol/L D-葡萄糖;(3)高滲對照組(mannitol):加入35 mmol/L甘露醇，用以排除高滲對細胞影響;(4)BAPTA-AM組(HG+BA):加入35 mmol/L葡萄糖和20 μmol/L BAPTA-AM，用于說明鈣超載與高糖誘導(dǎo)凋亡之間關(guān)系;(5)氯化鑭組(HG+La):加入35 mmol/L葡萄糖和20 μmol/L氯化鑭，用以說明鈣離子是否通過儲量操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)釋放;(6)NAC 組(HG+NAC):加入35 mmol/L葡萄糖和25 mmol/L NAC，用以說明ROS升高與與高糖誘導(dǎo)凋亡之間關(guān)系。

5 細胞內(nèi)ROS水平檢測

細胞內(nèi)ROS水平采用DCFH-DA熒光探針進行檢測。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中。在含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，加入處理藥物作用24 h，羰酰氰基對氯苯脘(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone，CCCP)作為陽性對照。使用無血清的α-MEM培養(yǎng)基洗1次后，加入30 μmol/L DCFH-DA 于37℃孵育1 h，每5 min振蕩細胞1次。用無血清的α-MEM培養(yǎng)基洗細胞3次后，倒置熒光顯微鏡檢測并分析熒光強度。此外藥物處理細胞后，常規(guī)消化，DCFH-DA染色后，流式細胞儀(FACSCalibur，Becton-Dickinson)進行檢測，CellQuestTM軟件 (Becton-Dickinson)分析并計算ROS陽性率。

6 細胞內(nèi)游離Ca2+水平的檢測

細胞內(nèi)Ca2+水平采用Fura-2/AM熒光探針進行檢測。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞，接種于100 mmol/L培養(yǎng)皿中。在含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，加入不同處理藥物培養(yǎng)24 h。使用D-Hanks液洗細胞3次后，加入20 μmol/L Fura-2/AM于37℃孵育1 h，每5 min振蕩細胞1次。用D-Hank's液洗細胞3次后，熒光分光光度計采用340、380 nm雙波長檢測熒光強度。先檢測靜息狀態(tài)下兩波長的熒光強度(F340和F380)，熒光最大值由加入為 10%Triton X-100 20 μL 測得(Fmax，340和Fmax，380)，熒光最小值由加入濃度為100 mmol/L的 EGTA 80 μL 測得(Fmin，340和 Fmin，380)，根據(jù)［Ca2+］(nmol/L)=Kd× ［(R-Rmin)× Fmin，380］/［(Rmax-R) × Fmax，380］(Kd=240 nmol/L，R=F340/F380，Rmin=Fmin，340/Fmin，380，Rmax=Fmax，340/Fmax，380)。

7 成骨細胞凋亡檢測

采用Annexin V-FITC/PI法檢測。取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中。在含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，加入處理藥物作用24 h。離心收集細胞，用冰凍的PBS洗細胞2次。用200 μL binding buffer重懸細胞后，加入10 μL Annexin V，避光4℃ 孵育30 min，再加入 100 μL binding buffer混勻后加入 5 μL PI 染液，避光4℃ 孵育5 min，流式細胞儀檢測，分析計算相對細胞凋亡率。(Annexin V)+PI-標(biāo)記為早期凋亡細胞，(Annexin V)+PI+標(biāo)記為晚期凋亡及壞死細胞，細胞相對凋亡率(%)=處理組凋亡率/正常組凋亡率×100%。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.1軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高糖對MC3T3－E1細胞增殖的抑制

高糖對MC3T3-E1細胞增殖有明顯的抑制作用，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，見圖1，24和48 h的IC50分別為35.23 mmol/L和37.87 mmol/L。

2 高糖可誘導(dǎo)MC3T3－E1細胞凋亡

高糖處理MC3T3-E1 24 h后可以引起明顯凋亡，見圖2A。早期凋亡率由(1.58±0.27)%增加至(24.16±3.53)%，細胞總死亡率由(6.03±0.75)%增加至(63.74±4.32)%(P＜0.01 vs正常組)，見圖2B，而甘露醇處理組的早期細胞凋亡率和細胞總死亡率與正常組相比無明顯差異(P＞0.05)，見圖2。

3 高糖通過提高細胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)MC3T3－E1細胞凋亡

Figure 1.Cell proliferation detected by MTT assay after high glucose treatment.±s.n=3.The curves showed doseeffect relationship.The half maximal(50%)inhibitory concentrations were 35.23 mmol/L and 37.87 mmol/L for 24 h and 48 h treatment，respectively.圖1 MTT檢測高糖對MC3T3－E1細胞增殖的影響

3.1 高糖提高細胞內(nèi)ROS水平 高糖處理MC3T3-E1細胞24 h后，ROS水平與對照組相比明顯升高，熒光波峰向右遷移(圖 3B)，ROS陽性率由(10.36±1.30)%升高到(40.52±8.65)%(P＜0.01 vs正常組)(圖3C)，ROS熒光強度明顯增強(圖3A-b)，與陽性對照強度相近(圖3A-e)。甘露醇組與正常組細胞內(nèi)ROS水平無明顯差別，見圖3A、B、C。NAC處理后，熒光波峰向左側(cè)回移(圖3B)，與高糖組相比ROS水平明顯下降，為(14.35±2.98)%(P＜0.01 vs高糖組)(圖3C)，ROS熒光強度減低(圖2A-d)。

Figure 2.The apoptosis of MC3T3-E1 cells detected by Annexin V/PI staining after high glucose treatment.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs control.圖2 高糖誘導(dǎo)MC3T3－E1細胞凋亡

Figure 3.High glucose induced an increase in ROS that triggered apoptosis in MC3T3-E1 cells.A:DCFH-DA fluorescent staining of the cells(×200).a:control group;b:high glucose(HG)treatment group;c:mannitol treatment group;d:HG+NAC treatment group;e:positive control group.B:flow cytometry analysis of the cells stained with DCFH-DA.C:quantified ROS level of the cells in different groups.D:cell death analysis in different groups.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs;##P＜0.01 vs HG.圖3 高糖通過提高細胞內(nèi)ROS水平引起MC3T3－E1細胞凋亡

3.2 高糖通過提高細胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)MC3T3-E1細胞凋亡 加入抗氧化劑NAC后，與高糖組相比，成骨細胞早期細胞凋亡率和總細胞死亡率明顯下降(P＜0.01)，與正常組相比無明顯差異(P＞0.05)，見圖3D。

4 高糖處理后可引起鈣超載

4.1 高糖提高細胞內(nèi)Ca2+水平增加 高糖處理MC3T3-E1細胞24 h后，細胞內(nèi)Ca2+水平與對照組相比明顯升高，由(226.37±21.38)nmol/L升高至(538.29±22.74)nmol/L(P＜0.01 vs正常組)，見圖4A。BAPTA-AM和La3+處理后，細胞內(nèi)Ca2+離子水平明顯下降，分別為(237.86±22.73)nmol/L和(251.86±20.95)nmol/L(P＜0.01 vs高糖組)，見圖4A。

4.2 高糖通過提高細胞內(nèi)ROS水平引起細胞凋亡加入抗氧化劑NAC后，成骨細胞早期細胞凋亡率和細胞總死亡率明顯下降(P＜0.01)，與正常組相比無明顯差異(P＞0.05)，見圖4B。

5 高糖處理后成骨細胞內(nèi)ROS與Ca2+水平的關(guān)系

5.1 抑制高糖所引起的成骨細胞內(nèi)ROS水平的提高可以降低細胞內(nèi)Ca2+水平 加入抗氧化劑NAC后，成骨細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯下降(P＜0.01)，與正常組相比無明顯差異(P＞0.05)，見圖5A。

5.2 抑制高糖所引起的成骨細胞內(nèi)Ca2+水平的提高可以降低細胞內(nèi)ROS水平 BAPTA-AM和La3+處理后，成骨細胞內(nèi)ROS濃度明顯下降(P＜0.01)，與正常組相比無明顯差別(P＞0.05)，見圖5B。

討 論

骨質(zhì)疏松癥是指單位體積骨量減少伴有骨強度降低，主要與骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡破壞相關(guān)。其中骨的形成和吸收分別由成骨細胞和破骨細胞完成［4］。成骨細胞的數(shù)量和活性決定了骨形成水平，從而影響骨量。凋亡作為細胞生理、病理的最終階段，在骨質(zhì)疏松當(dāng)中起到了重要的作用。成骨細胞凋亡的增加導(dǎo)致成骨細胞數(shù)量減少，骨形成水平降低，骨量減少［5］。

Figure 4.High glucose induced an increase in［Ca2+］ithat triggered apoptosis of MC3T3-E1 cells.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG.圖4 高糖通過提高細胞內(nèi)Ca2+水平引起MC3T3－E1細胞凋亡

Figure 5.The interaction of ROS and Ca2+after high glucose treatment.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs HG.圖5 高糖處理后成骨細胞內(nèi)ROS與Ca2+水平變化

骨質(zhì)疏松癥和糖尿病是目前常見的兩種疾病。流行病學(xué)調(diào)查表明，糖尿病患者的骨量明顯降低，骨折的風(fēng)險明顯增加［1-2］。高糖可以通過多種途徑誘導(dǎo)細胞凋亡［6］，我們研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高糖處理的成骨細胞凋亡明顯增加，這與Zalavras等［7］的研究一致。

高濃度的細胞內(nèi)Ca2+可以引起多種細胞凋亡［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)高糖處理后可以引起成骨細胞內(nèi)Ca2+濃度升高。使用Ca2+螯合劑BAPTA-AM降低細胞內(nèi)Ca2+濃度后，細胞凋亡明顯降低。而這種Ca2+增加可被SOCC抑制劑La3+阻斷，這說明了高糖所引起的細胞內(nèi)Ca2+水平升高可能是通過SOCC的開放引起。SOCC是位于細胞質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上Ca2+通道，當(dāng)外界因素刺激后，SOCC開放，可以引起細胞外以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放，從而引起細胞內(nèi)Ca2+水平升高［9］。通過抑制SOCC降低細胞內(nèi)Ca2+水平，可以抑制高糖所引起的成骨細胞凋亡，說明了高糖可以使SOCC開放，引起細胞內(nèi)Ca2+增加，從而導(dǎo)致成骨細胞凋亡。

ROS能夠誘導(dǎo)細胞內(nèi)Ca2+濃度增加［10］。另一方面，增加的細胞內(nèi)Ca2+可以促進ROS產(chǎn)生［11］。本研究顯示預(yù)處理BAPTA-AM和La3+降低了高糖所引起的成骨細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，同時細胞內(nèi)Ca2+增加亦能被預(yù)處理的NAC所阻斷，表明高糖誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生可以引起細胞內(nèi)鈣離子增加。但是高糖誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生、增加Ca2+內(nèi)流的潛在機制仍然不清楚。ROS已知可以與多種離子轉(zhuǎn)運蛋白相互作用［12］，例如Ca2+通道。ROS誘導(dǎo)離子轉(zhuǎn)運體改變的具體機制，包括了可以氧化定位在離子轉(zhuǎn)運體蛋白上的巰基基團、過氧化膜脂質(zhì)、抑制膜結(jié)合的調(diào)節(jié)酶類等［13-14］。因此，高糖誘導(dǎo)細胞內(nèi)鈣離子增加可能與鈣離子通道所通過的膜被ROS脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

總之，本研究表明，高糖可以通過開放細胞膜上的SOCC，促進胞外Ca2+內(nèi)流，造成成骨細胞內(nèi)鈣超載，Ca2+與ROS相互促進，并進一步加劇了鈣超載，引起成骨細胞凋亡。

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