王建衛(wèi)， 李 杭， 潘志軍

(浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院骨科，浙江杭州310009)

近期的許多研究表明他汀類藥物具有促成骨作用［1－3］。我們的前期研究也證實了降脂藥－辛伐他汀(simvastatin，SVS)局部注射能促進去勢大鼠骨折愈合的質(zhì)量［4］，但他汀類藥物對骨代謝的確切機制目前尚缺乏深入的研究。

骨保護蛋白(osteoprotegerin，OPG)作為一種最近發(fā)現(xiàn)的可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，被認為對骨代謝起著重要作用。OPG是一種由成骨/基質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞等分泌的蛋白多糖，其通過與破骨細胞分化因子(osteoprotegerin ligand/receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，OPGL/RANKL)競爭性結合，阻止OPGL/RANKL與破骨細胞及其前體細胞膜上的受體RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)相結合，從而阻斷OPGL/RANKL對破骨細胞各階段產(chǎn)生的作用，達到抑制骨吸收的作用［5］。已有研究表明白細胞介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子 β(tumor necrosis factor β，TNF－β)、1，25 二羥基維生素 D3［1，25(OH)－D3］、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2，BMP－2)、轉化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF－β)、雌激素等均能刺激成骨細胞OPG mRNA及其蛋白的表達［6－7］。雖然已有少量研究表明他汀類藥物也可影響體外培養(yǎng)人成骨細胞或人體血液中的OPG表達水平［8－10］，但目前尚缺乏體內(nèi)組織學水平的研究結果。我們在前期研究的基礎上，對骨折標本進一步研究，以了解去勢及辛伐他汀對新生骨痂OPG表達情況的影響，為他汀類成骨作用的機制研究提供更多的證據(jù)。

材料和方法

1 動物

2月齡雌性SD大鼠(清潔級，購自浙江大學實驗動物中心)，初始體重178～201 g，飼養(yǎng)于清潔級動物房，23℃恒溫，晝夜12 h。大鼠飼料含鈣0.46%，含磷0.38%，自由進食自來水。

2 去勢

大鼠隨機分成OVX組(n=60)和假手術(sham)組(n=30)。按以往方法對大鼠行去勢術［11］。術后喂養(yǎng)于原環(huán)境。為了減少OVX后大鼠體重的增加，對OVX組大鼠實行飲食控制(即給予和sham組大鼠等量的食物)。

術后12周，各取10只大鼠，全麻后測量右側脛骨骨礦物含量(bone mineral density，BMD)。本實驗使用雙能X線吸收儀(dual－energy X－ray absorptiometer，DEXA，LUNAR Radiation)，應用其配套的小動物模式進行BMD的測量，測量電壓為76 kV，電流為150 μA。該儀器的準確率為0.3%，組間變異系數(shù)(CV)為1.3%。

3 骨折內(nèi)固定模型

所有大鼠分成sham+vehicle組(n=30)、OVX+vehicle組(n=30)和OVX+SVS組(n=30)，進一步用以建立骨折內(nèi)固定模型。全麻后，在右脛骨近1/3處用骨刀平整切斷脛骨，盡量不折斷同側腓骨，為穩(wěn)定骨折端，用直徑0.5 mm的消毒牙科鋼絲(上海醫(yī)用縫針廠)經(jīng)脛骨結節(jié)插入，對骨折端行髓內(nèi)固定，縫合切口，術后抗炎3 d(青霉素8×105U，im，每天2次)。

4 給藥

骨折端皮下注射SVS或空白溶劑(vehicle)，骨折手術當天注射1次，骨折后連續(xù)5 d，每天2次。按文獻方法配制5%SVS溶液［1］，即SVS溶解于含2%二甲亞砜和0.1%小牛血清白蛋白的PBS溶液中。每次注射5 mg·kg－1的SVS或相應體積(約30～50 μL)的vehicle溶劑。本實驗的注射方法參照文獻方法進行［1］。為了避免局部反復注射對骨折愈合的干擾，本實驗中的局部注射是指鄰近骨折端的皮下注射，而不是向骨痂內(nèi)的直接注射。注射針頭直徑為0.4 mm，注射器最大刻度為250 μL，最小刻度為10 μL(上海醫(yī)用激光儀器有限公司)。注射過程中避免對骨痂的干擾。

5 組織學分析

骨折后1、2、4周每組各取5只用作組織學分析。處死大鼠后連同骨痂周圍骨膜取下右側脛骨。抽出髓內(nèi)釘，切取包含骨痂的骨段，4%多聚甲醛(pH 7.4)室溫下固定24 h，EDTA 液(0.5 mol/L，pH 7.4)脫鈣3～5周，每5～7 d更換新鮮脫鈣液至能被細針輕松插入。PBS液沖洗，乙醇梯度脫水，石蠟包埋。縱向5μm切片，固定于經(jīng)0.01% 多聚賴氨酸表面處理的載玻片上，60℃烘干過夜。

脫鈣組織切片予增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(武漢博士德生物工程有限公司)和OPG抗體(sc－8468)(Santa Cruz Biotechnology)免疫組化染色，每周取5個標本，每個標本1張切片，每張切片4個高倍(×400)視野。計算每個視野下所有細胞中PCNA陽性細胞占有率(分成36個單元格計數(shù))，計算4個視野的平均值比較。對OPG免疫組化結果進行半定量分析。每張切片按染色強度記分為:弱:1;中:2;強:3。按染色范圍記分為:1:＜25%;2:25%～50%;3:＞50%。上述評分相加所得值分級為:+:2.0 ～3.0;++:3.0 ～4.5;+++:4.5 ～6.0。

6 統(tǒng)計學處理

本實驗為成組設計。用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。BMD及PCNA陽性率數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，行方差分析。對于OPG染色情況行多組完全隨機設計資料的Mann－Whitney秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

OVX后12周，sham組和OVX組脛骨BMD有顯著差異［分別為(0.241 ±0.010)g/cm2和(0.219 ±0.005)g/cm2，P＜0.01］。

骨折后OVX+vehicle組和OVX+SVS組分別有4只和3只大鼠死亡。無1例發(fā)生骨折端感染。3組大鼠間體重沒有顯著差異。

PCNA免疫組化陽性細胞呈棕黃色，定位在細胞核中，陰性細胞呈藍色。結果顯示OVX+vehicle組骨折后1、2、4周PCNA陽性率較sham+vehicle組分別下降17.3%、32.1%和26.1%(P＜0.01);OVX+SVS組骨折后1、2、4周 PCNA 陽性率較 OVX+vehicle組分別增加60.1%、67.7%和67.7%(P ＜0.01)，見圖1、表1。該結果提示去勢可影響骨折愈合過程中骨痂的細胞增殖，而SVS可促進骨痂細胞增殖，與我們前期的生物力學及形態(tài)學研究結果相一致［3］。

Figure 1.PCNA immunohistochemical staining of bone callus(×400).圖1 骨折后各周骨痂PCNA免疫組化染色

表1 骨痂PCNA免疫組化染色陽性率比較Table 1.Comparison of PCNA positive staining(%.±s.n=5)

表1 骨痂PCNA免疫組化染色陽性率比較Table 1.Comparison of PCNA positive staining(%.±s.n=5)

△△P＜0.01 vs sham+vehicle group;##P＜0.01 vs OVX+vehicle group.

Group 1 week 2 weeks 4 weeks Sham+vehicle 48.51 ±4.12 53.45 ±5.68 22.80 ±2.16 OVX+vehicle 40.10 ±1.64△△ 41.10 ±1.43△△ 16.84 ±2.14△△OVX+SVS 64.21 ±4.89## 68.93 ±0.64## 28.24 ±1.67##

OPG陽性染色呈棕黃色，主要表達在成骨細胞和軟骨細胞中，在骨基質(zhì)中也有彌漫性黃染。半定量結果顯示OVX+vehicle組OPG表達水平最低，sham+vehicle組最高，而OVX+SVS組的OPG表達水平介于2組之間，見圖2、表2。OVX+SVS組與OVX+vehicle組間在骨折后各周均有極顯著差異(P＜0.01)，OVX+vehicle組與sham+vehicle組間在骨折后1、2周也有顯著差異(P＜0.05)。該結果表明去勢可明顯減少新生骨OPG的表達，而SVS可部分阻止因去勢引起的OPG分泌減少。

討 論

本研究從動物體內(nèi)組織學水平研究了去勢及辛伐他汀局部應用對大鼠骨痂OPG表達的影響。

辛伐他汀口服后，絕大部分沉積在肝臟，僅5%分布在血液中［12］，在骨骼中的濃度則更低，如此低的濃度極易受到很多因素的干擾從而造成臨床結果的變異。同時，在正常骨骼中，由于骨重建單位相對較少，他汀類藥物的骨骼作用受到一定的限制，而在骨折愈合過程中，骨重建單位大大增加，因此，骨骼對藥物反應的表現(xiàn)將被放大。在本實驗中，辛伐他汀通過局部微量注射器被注射于骨折端皮下。這樣可通過局部簡單擴散作用增加骨折端的藥物濃度，該濃度將遠比通過整體給藥所能達到的骨折端濃度高。

PCNA是一個分子量為37 kD的蛋白，特異地表達于細胞增殖周期的S期。在腫瘤病理學檢查中常用于判斷腫瘤的良惡性。在骨折愈合過程中，PCNA的表達強度可以反映骨痂中的細胞增殖情況。本實驗發(fā)現(xiàn)去勢組骨痂PCNA表達較空白對照組低，而實驗組較去勢組高，差異均有顯著性。該結果從另一角度證明了去勢可影響大鼠骨折愈合的質(zhì)量，而辛伐他汀局部注射可促進去勢大鼠的骨折愈合。

骨量的維持依賴于骨形成過程與骨吸收過程之間的動態(tài)平衡，任何影響骨代謝的因素均通過調(diào)節(jié)這一動態(tài)平衡而發(fā)揮作用。抗骨質(zhì)疏松藥根據(jù)其作用機制可分為促成骨類藥物和抗骨吸收藥物，目前治療骨質(zhì)疏松的大多數(shù)藥物，如雌激素、雙膦酸鹽類化合物、降鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等，主要通過抑制骨吸收防止骨量丟失，而刺激新骨形成的藥物為數(shù)很少。他汀類藥物自最初被Mundy等［1］發(fā)現(xiàn)具有促成骨作用以來，隨后的很多研究均表明他汀類藥物可直接刺激成骨細胞BMP－2的表達［13－14］，從而直接促進成骨細胞的成骨作用。因而他汀類藥物被認為是一種具有直接促成骨作用的潛在抗骨質(zhì)疏松藥物。

Figure 2.OPG immunohistochemical staining of bone callus(×400).圖2 骨折后各周骨痂OPG免疫組化染色

表2 骨痂OPG免疫組化陽性染色半定量分析Table 2.Semiquantitative analysis of OPG

OPG是成骨細胞分泌的一種新的TNF受體超家族成員，是成骨細胞調(diào)節(jié)破骨細胞分化及其活性的重要物質(zhì)。OPG對可競爭性結合RANKL，從而抑制RANKL與破骨細胞及其細胞上RANK相結合，最終起到抑制破骨細胞增殖和分化。本實驗發(fā)現(xiàn)，去勢可使大鼠骨痂OPG表達減少，該結果從反面提示了雌激素通過OPG發(fā)揮抑制破骨細胞的作用機制，與以往的實驗相一致［6］。同時，本實驗還發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可使去勢大鼠骨痂OPG表達增加，提示他汀類藥物不僅能刺激成骨細胞表達BMP－2，直接促進成骨細胞增殖分化，同時還通過刺激成骨細胞表達OPG間接抑制破骨細胞的增殖分化。

當然，本實驗尚存在一些不足之處。首先，我們未能對破骨細胞的數(shù)量和功能作直接或間接的檢測;其次，我們也未能對成骨細胞表達的其它因子，如BMP－2、RANKL等予以檢測。盡管如此，結合目前已有的對于OPG骨調(diào)節(jié)作用的認識，本研究提示他汀類藥物還具有間接抑制破骨細胞的作用。

［1］ Mundy G，Garrett R，Harris S，et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins［J］.Science，1999，286(5446):1946－1949.

［2］ Montagnani A，Gonnelli S，Cepollaro C，et al.Effect of simvastatin treatment on bone mineral density and bone turnover in hypercholesterolemic postmenopausal women:a 1－year longitudinal study［J］.Bone，2003，32(4):427－433.

［3］ Pauly S，Luttosch F，Morawski M，et al.Simvastatin locally applied from a biodegradable coating of osteosynthetic implants improves fracture healing comparable to BMP－2 application［J］.Bone，2009，45(3):505－511.

［4］ 王建衛(wèi)，徐少文，楊迪生.辛伐他汀局部注射對大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(2):377－382.

［5］ Suda T，Takahashi N，Udagawa N，et al.Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families［J］.Endocr Rev，1999，20(3):345－357.

［6］ Hofbauer LC，Dunstan CR，Spelsberg TC，et al.Osteoprotegerin production by human osteoblast lineage cells is stimulated by vitamin D，bone morphogenetic protein 2，and cytokines［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，250(3):776－781.

［7］ Hofbauer LC，Khosla S，Dunstan CR，et al.Estrogen stimulates gene expression and protein production of osteoprotegerin in human osteoblastic cells［J］.Endocrinology，1999，140(9):4367－4370.

［8］ Viereck V，Gründker C，Blaschke S，et al.Atorvastatin stimulates the production of osteoprotegerin by human osteoblasts［J］.J Cell Biochem，2005，96(6):1244－1253.

［9］ Nezami N，Safa J，Eftekhar－Sadat AT，et al.Lovastatin raises serum osteoprotegerin level in people with type 2 diabetic nephropathy［J］.Clin Biochem，2010，43(16－17):1294－1299.

［10］ Stein SH，Dean IN，Rawal SY，et al.Statins regulate interleukin－1β－induced RANKL and osteoprotegerin production by human gingival fibroblasts［J］.J Periodontal Res，2011，46(4):483－490.

［11］ Wang JW，Li W，Xu SW，et al.Osteoporosis influences the middle and late periods of fracture healing in a rat osteoporostic model［J］.Chin J Traumatol，2005，8(2):111－116.

［12］ Blum CB.Comparison of properties of four inhibitors of 3－h(huán)ydroxy－3－methylglutaryl－coenzyme A reductase［J］.Am J Cardiol，1994，73(14):3D－11D.

［13］ Ohnaka K，Shimoda S，Nawata H，et al.Pitavastatin enhanced BMP－2 and osteocalcin expression by inhibition of Rho－associated kinase in human osteoblasts［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，287(2):337－342.

［14］ Maeda T，Matsunuma A，Kurahashi I，et al.Induction of osteoblast differentiation indices by statins in MC3T3－E1 cells［J］.J Cell Biochem，2004，92(3):458－471.