張 彬，譚 巖

（1．吉林大學第一臨床學院，吉林 長春130021；2．內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院，通遼028007；3．吉林省人民醫(yī)院 醫(yī)學診治實驗中心，吉林 長春130021）

血液中蘊藏著與疾病發(fā)生機制、早期診斷及預后評估密切相關的巨大信息，已成為臨床上最為常見且最為重要的診斷標本。從血液中發(fā)現(xiàn)生物標記物是蛋白質(zhì)組學研究的重點之一。雙向電泳技術目前仍是蛋白質(zhì)組學的主要實驗技術，而樣本的準備是實驗成功的關鍵。血漿／血清中包含多種多樣蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的濃度范圍至少達12個數(shù)量級，其中高豐度蛋白中前22種蛋白在血漿蛋白質(zhì)中占99%，白蛋白和免疫球蛋白就占血漿總蛋白的60%，低豐度蛋白僅占全部血漿蛋白的1%，而疾病的標志物常常是在疾病過程中由機體分泌到血漿中的低豐度蛋白質(zhì)。高豐度蛋白的存在對目標蛋白質(zhì)的分析造成極大困難［1，2］。本實驗分析了4種大鼠血清處理方法對雙向電泳分離效果的影響，為血清雙向電泳標本的處理提供參考。

1 材料與方法

1．1 標本

wistar雌性大鼠，體重180－220g，購于吉林大學白求恩醫(yī)學部實驗動物中心。大鼠眼球取血，靜止分離血清，3 000r／min，離心10min，分裝后凍存于－80℃冰箱。

1．2 試劑和儀器

1．2．1 尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、3－［（3－膽酰胺丙基）－乙二胺］－1－丙磺酸（CHAPS）、賴氨酸（Lysine）、二硫蘇糖（DTT）、兩性電解質(zhì)（Pharmalyte，pH 3－10）、13cm 固相pH 梯度干膠條（pH 3－10）、甘油（Glycerol）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、碘乙酰胺（Iodoacetamide，IAA）、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（N，N＇－methylenebisacrylamide）、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、甘氨酸（Glycine）、瓊脂糖、2－D Quant定量試劑盒均購自Amersham Biosciences公司；異丁醇、溴酚藍（Bromophenol blue）、丙酮、三氯乙酸（TCA）均購自北京化工廠（北京北化精細化學品有限責任公司）。

ProteoExtract Protein Precipitation和 KitProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit均 購 于Merck公司。

1．2．2 儀器：Ultrospec 3300Pro分光光度計、Ettan IPGphorⅡ等電聚焦電泳儀、Ettan DALT Six電泳系統(tǒng)、凝膠圖像掃描儀（ImageScanner）。

1．3 實驗方法

1．3．1 方法1，取5μl大鼠血清用45μl裂解液直接溶解。

1．3．2 方法2，取大鼠血清用 ProteoExtract Protein Precipitation Kit處理后，取適量裂解液溶解。

1．3．3 方法3，改良的 TCA／丙酮沉淀法：在20μl大鼠血清中加入80μl預冷的10%TCA／丙酮溶液，混勻，－20℃放置90min后，12 000g，4℃，離心20 min。移開上清，用1ml預冷的丙酮洗沉淀，置于冰上15min，離心同上。

1．3．4 方法4，按照 ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit說明書操作。取35μl大鼠血清，以結合緩沖液（Binding Buffer）十倍稀釋。去除分離柱中的貯存緩沖液，將柱子放入大小適合的收集試管，加入850μl結合緩沖液，讓其靠重力流過柱體，將柱子放入另一收集試管中。加入稀釋后的樣本，讓其靠重力流過柱體，以600μl結合緩沖液清洗柱體兩次，上述三步的洗脫組份，即為去除白蛋白／IgG后的樣本。用 ProteoExtract○RProtein Precipitation Kit（購于Merck公司）沉淀蛋白。

1．3．5 將以上4種方法處理過的蛋白用裂解液溶解后，用Bradford法測蛋白濃度取100μg用13cm IPG干膠條水化12h，等電聚焦條件為250V，1h；500V，1h；1 000V，1h；8 000V，1h；8 000V，4h。聚焦完畢后，將膠條放置于濾紙上，輕輕吸干膠條上的礦物油后分別將膠條在含有1%DTT和2．5%碘乙酰銨的平衡液中平衡15min。將平衡后的膠條移至濃度為10%（方法2）或12．5%的SDS－PAGE膠上進行雙向電泳，條件為10mA／膠1h，25mA／膠恒流，直至溴酚藍達膠底線。卸膠，進行硝酸銀染色，染色后用凝膠圖像掃描儀（ImageScanner）獲取圖像后用ImageMasterTM2DPlatinum（GE Healthcare）軟件分析。

2 結果

2．1 不同方法處理后的雙向電泳圖譜比較

未經(jīng)處理的大鼠血清樣品，經(jīng)雙向電泳后，存在大量的縱橫條紋，幾乎無蛋白點（見圖1a），蛋白質(zhì)點分離效果差。經(jīng)試劑盒去除雜質(zhì)并沉淀，但未去除高豐度蛋白的血清樣品，電泳圖譜得到的蛋白位點仍很少，同時縱橫條紋多（（見圖1b））；用TCA－丙酮法處理的樣本電泳圖譜雖有較多粗的縱橫條紋，但所得的蛋白點數(shù)明顯增多，有較多呈圓點狀，散在分離的蛋白點出現(xiàn)（圖1c）；采用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit血清樣本電泳圖譜所得的蛋白點較多，縱衡條紋明顯見少，大多數(shù)蛋白位點呈圓點狀，散在分離，邊界分辨清楚。見圖1。

2．2 不同處理方法后樣品的2－DE圖譜比較

分別將未經(jīng)處理的大鼠血清，經(jīng)試劑盒沉淀（購于Merck公司）的大鼠血清，在一定量的血清中加入4倍體積的10%TCA／丙酮的方法處理和用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit處 理的大鼠血清的2－DE圖譜進行3次重復性檢測，平均蛋白質(zhì)點數(shù)分別為610±54，610±46，683±42和865±39，平均匹配點數(shù)分別為532±39，543±51，623±42和746±52，匹配率分別為83．4%，86．2%，82．3%和85．5%，且3塊膠在蛋白質(zhì)點位置上有較好的重復性，不同凝膠間蛋白質(zhì)點在IEF方向的偏差分別為（0．87±0．31）mm，（0．79±0．23）mm，（0．82±0．33）mm 和（0．85±0．30）mm，在SDS－PAGE方向上的偏差分別為（0．84±0．42）mm，（0．81±0．39）mm，（0．99±0．16）mm 和（0．97±0．12）mm。由此可見采用在一定量的血清中加入4倍體積的10%TCA／丙酮的方法處理和用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit處 理的大鼠血清的這兩種去除白蛋白的方法處理大鼠血清后均能得到分辨率較高且重復性好的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜，且采用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit優(yōu)于在一定體積的血清中加入4倍體積的10%TCA／丙酮的方法。4種方法處理后大鼠血清雙向電泳圖譜結果比較見圖1。

圖1 4種不同方法處理大鼠血清得到的2－DE圖譜

3 討論

Hyoung－Joo Lee等［3］認為對血漿或血清進行預處理可以降低樣品的復雜性，為低豐度蛋白的檢測創(chuàng)造條件還可以將檢測蛋白質(zhì)的動力學范圍延伸以利于后續(xù)的質(zhì)譜分析?，F(xiàn)在低豐度蛋白的富集方法主要有［4］①親和技術包括染料親和法抗體親和法，②有機溶劑抽提法③血漿蛋白的預分離技術包括二維液相色譜法、Zoom IEF組分分離法、介體電泳技術（Gradiflow法）及自由流電泳等。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的PH中各解離基團解離程度不同，當溶液的PH值與蛋白質(zhì)的等電點相同時，蛋白質(zhì)分子呈現(xiàn)電中性，分子間無排斥力，易于積聚和沉淀。溶液的極性可以影響蛋白質(zhì)的溶解度，有機溶劑的加入降低了溶液的介電常數(shù)而增加蛋白質(zhì)分子間的作用力，導致其溶解度降低，同時破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，減少了蛋白質(zhì)與水間的作用力使蛋白質(zhì)沉淀。Oleg Chertov等［5］對有機溶劑沉淀血清中蛋白質(zhì)進行了質(zhì)譜鑒定，鑒別生物標志物。AJ．Alpert等［6］報道使用ACN沉淀血漿中高分子量的高豐度蛋白以相對富集低豐度蛋白。Chen等［7］發(fā)明了一種改良的TCA／丙酮沉淀法，將一定體積的血清中加入4倍體積的10%TCA／丙酮溶液，可有效地去除血清中的白蛋白，并且去除白蛋白的特異性很高。市場上應用親和技術去除血漿／血清中的高豐度蛋白試劑盒很多，常用的有基于抗體的親和法和基于染料的親和法。抗體親和法利用抗原抗體反應的原理，用針對血漿／血清中多種高豐度蛋白的單克隆或多克隆抗體來特異性去除血漿中的高豐度蛋白；染料親和法通過高豐度蛋白與染料環(huán)結構之間復雜的靜電、疏水鍵及氫鍵相互作用去除血漿中的高豐度蛋白，其特異性相對較低。

大鼠血清樣本經(jīng)以上4種方法處理后，雙向電泳圖像分析結果顯示，未經(jīng)處理的大鼠血清中不但包含高豐度蛋白而且含有高濃度的鹽類，脂類和核酸等，嚴重干擾了蛋白點的分離，圖像中含有大量橫紋及縱紋，蛋白質(zhì)點分離效果差。經(jīng)過試劑盒沉淀但未去除白蛋白的大鼠血清樣本由于白蛋白含量高，干擾了低豐度蛋白的檢測，用銀染的方法進行染色時，當?shù)拓S度蛋白顯色時由于染色時間已過長膠片上出現(xiàn)大量橫紋。用改良的TCA／丙酮沉淀法處理的大鼠血清樣本，雖然白蛋白去除并不完全但蛋白質(zhì)點分離較好。采用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit處理大鼠血清樣本后，雙向電泳圖譜中可見對白蛋白的去除效果較好，但對IgG的去除效果不理想，但相對其他3種方法，蛋白質(zhì)點更加清晰，分離較好。綜上所述，用改良的TCA／丙酮沉淀法和采用ProteoExtractTMAlbumin／IgG Removal Kit處理的大鼠血清樣本，進行雙向電泳均可以得到蛋白質(zhì)點分散較好的電泳圖譜，且后者更優(yōu)于前者，但改良的TCA／丙酮沉淀法取材容易、實驗成本低、可重復性好，兩種方法各有優(yōu)勢。

［1］Anderson N L，Anderson N G．The human plasma proteome：history，character，and diagonostic prospects［J］．Mol Cell Proteomics，2002，1（11）：845．

［2］M．Fountoulakis，J．－F．Juranville，L．Jiang．Depletion of the highabundance plasma proteins［J］．Amino Acids，2004，27：249．

［3］Hyoung－Joo Lee，Eun－Young Lee，Min－Seok Kwon，et al．Biomarker discovery from the plasma proteome using multidimensional fractionation proteomics［J］．Current Opinion in Chemical Biology，2006，10：42．

［4］邱宗蔭，尹一兵．臨床蛋白質(zhì)組學［M］．北京：科學出版社，2008．162－175．

［5］Oleg Chertov，Arya Biragyn，Larry W．Kwak．Organic solvent extraction of proteins and peptides from serum as an effective sample preparation for detection andidentification of biomarkers by mass spectrometry［J］．Proteomics，2004，4，1195．

［6］AJ．Alpert，A．K．Shukla．Precipitation of large，high－abundance Proteins from serum with Organic solvents，ABRF 2003，Poster#Plll－W．

［7］Chen Y，Lin S，Yeh YY，et al．A modified protein precipitation procedure for efficient removal of albumin from serum［J］．Electrophoresis，2005，26：2117．