趙洪昌，趙文靜，劉 薇，葉冬霞

（1．長春急救中心，吉林 長春130062；2．吉林省肝膽病醫(yī)院，吉林 長春130062）

間 充 質 干 細 胞 （Mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有多向分化潛能的干細胞，具有高度可塑性，在特定的誘導條件下可分化為不同胚層來源的細胞，其生物學特點使其在臨床治療如組織和器官修復等方面具有廣闊的應用前景［1，2］。在一定誘導條件下MSCs可分化為中胚層的骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞，外胚層的神經元、神經膠質細胞及內胚層的肝細胞［3－5］。MSCs向心肌細胞的分化為擴張性心肌病、心肌梗死等的治療帶來了新的希望。研究證明，5－氮胞苷可誘導MSCs定向分化為心肌樣細胞，但如何誘導MSCs定向分化為心肌細胞仍是需要重點研究的問題，為此本研究在分離培養(yǎng)臍血MSCs的基礎上，采用5－氮胞苷誘導培養(yǎng)臍血MSCs分化為心肌樣細胞，為臨床應用MSCs治療心血管疾病提供實驗基礎和理論依據。

1 材料和方法

1．1 材料

低糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青）；胰蛋白酶、5－氮胞苷（Sigma）；臍血／骨髓干細胞處理試劑盒（寧夏中聯達公司）；鼠抗人肌鈣蛋白（cTnT）單抗（丹麥DAKO公司），SP免疫組化試劑盒（邁新公司）。

1．2 臍帶血采集

選擇30歲以下剖宮產婦采集臍帶血，孕婦健康、無急慢性疾病，抗HIV、抗HCV及乙肝病毒標志物檢測均為陰性。此項研究經醫(yī)院倫理委員會批準，前期告知孕婦并簽署知情同意書。新生兒產出后立即在距臍輪5－7cm處鉗夾結扎臍帶并切斷，行臍帶靜脈穿刺直接將臍血引流入裝有枸櫞酸鈉抗凝劑的一次性采血袋內，臍帶血采集完畢后置冰盒內運輸至實驗室進行細胞分離培養(yǎng)。

1．3 臍血MSCs的分離培養(yǎng)

臍血單個核細胞的分離采用臍帶血細胞處理試劑盒，嚴格按照試劑盒說明書操作。分離后計數并檢測細胞存活率（臺盼藍染色）。分離獲得的單個核細胞，無血清DMEM培養(yǎng)液洗2次，以2×106／ml接種于60mm培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)72h后換液，以后每3－4d換液1次，約10－1 4d細胞80%融合時，胰酶消化傳代培養(yǎng)。鏡下逐日觀察細胞生長情況。

1．4 臍血MSCs的表型和分化潛能鑒定

取3代臍血MSCs細胞以1×104／孔接種于24孔培養(yǎng)板中（孔中預先放置無菌蓋玻片），二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長接近80%融合時，取出蓋玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定10min，免疫組織化學染色檢測細胞表面分子CD29、CD44、CD34的表達；

根據文獻［6］。3代臍血 MSCs的細胞，含20%馬血清的培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)，隔日換液；對照組取同代細胞，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)14d后取出中蓋玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定10min，油紅O染色鑒定細胞分化情況。

1．5 5－氮胞苷誘導培養(yǎng)臍血MSCs

取第3代MSCs，以細胞濃度1×105／mL接種于6孔板內（孔內預置無菌蓋玻片），培養(yǎng)24h更換培養(yǎng)基為含10μmol／L 5－氮胞苷低糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)24h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，更換為常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；對照組始終采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)不同時間點取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定10min，風干后保存于－20℃待檢。

1．6 免疫組織化學法檢測臍血MSCs的表達

嚴格按照試劑盒說明書進行操作。取出已固定細胞爬片，PBS濕化20min，3%H2O2甲醇液封閉內源性過氧化物酶，PBS沖洗后，滴加正常山羊血清封閉30min，滴加鼠抗人cTnT單抗（1∶200稀釋），對照組用PBS代替，37℃孵育1h，PBS沖洗后滴加辣根過氧化物酶標記兔抗鼠二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，封片，鏡下觀察染色結果。結果判定：陽性細胞胞漿內出現棕褐色顆粒，顯微鏡下計數5個低倍視野，計算陽性細胞百分率。

1．7 統計分析

實驗數據以ˉx±s表示，兩組數據間比較用兩樣本t檢驗。采用SPSS13．0軟件包進行統計學分析。

2 結果

2．1 臍血MSCs的分離培養(yǎng)、表型和分化潛能鑒定

從臍帶血分離的單個核細胞培養(yǎng)72h后換液，部分細胞貼壁并分裂增殖形成集落，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞集落不斷增多，擴大，約10－14d細胞融合，進行傳代培養(yǎng)。傳代臍血MSCs很快貼壁，呈梭形均勻分布，增殖迅速，傳代周期為6－7d（見圖1）。

免疫細胞化學染色結果顯示：臍血MSCs高表達CD44和CD29，不表達CD34。成脂肪誘導組細胞變得稍大而扁平，油紅O染色后鏡下觀察可見，細胞核呈淺藍色，胞漿內有橘紅色脂肪滴；對照組細胞無形態(tài)改變，油紅O染色后胞漿內無橘紅色脂肪滴（見圖2）。結果表明，臍血MSCs可定向誘導分化為脂肪細胞。

Fig．1 Morphological features of human cord blood MSCs（×40）

Fig．2 Red oil O staining of human cord blood MSCs（×200）

2．2 誘導培養(yǎng)組MSCs的形態(tài)學觀察和cTnT的免疫組化染色結果

對照組MSCs未發(fā)生形態(tài)改變，呈成纖維細胞樣整齊排列；5－aza誘導組MSCs生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)7d細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈緊密平行排列生長，體積變大，隨著培養(yǎng)時間的延長，多數細胞呈桿狀，少數細胞呈不規(guī)則外形，相鄰細胞間的胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀。

5－aza誘導組 MSCs培養(yǎng)7d、14d、21d、28d cTnT均呈陽性表達，其表達陽性率分別為（17．2±4．2）%、（21．5±5．8）%、（42．3±8．5）%和（70．4±11．5）%，隨時間延長cTnT表達陽性率增高，不同時間點陽性率比較差異有統計學意義（P＜0．05）；未經5－aza誘導的MSCs中未見cTnT表達。

3 討論

大量研究已表明，臍帶血中含有大量的造血干細胞以及豐富的MSCs，臍帶血干細胞的體外增殖、分化能力、集落形成能力、刺激后進入細胞周期的速度以及自泌生長因子的能力均強于骨髓及外周血來源干細胞，臍血為一種良好的 MSCs來源［7，8］。本研究采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結合分離培養(yǎng)臍血MSCs，結果顯示，密度梯度離心獲得的單個核細胞培養(yǎng)72h后大部分細胞貼壁，呈集落式生長，傳代細胞增殖迅速、呈均勻有序的成纖維細胞樣分布，傳代周期為6－7d。體外鑒定MSCs主要是根據細胞的形態(tài)和培養(yǎng)特性、表型以及分化潛能等，本研究從臍血分離的MSCs高表達表面分子CD44和CD29表達，不表達CD34表達，體外可定向誘導分化為脂肪細胞。研究結果表明密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結合可獲得較純化，高活性的臍血MSCs，與文獻報道一致，為進一步實驗奠定了基礎。

Fig．3 The morphology feature and expression of cTnT in MSCs（×100）

MSCs具有多向分化潛能，可定向分化為心肌細胞和血管內皮細胞，MSCs已經成為心血管疾病細胞移植治療的理想種子細胞，是近年來心血管疾病領域的研究熱點，5－aza是目前公認的可以誘導MSCs向心肌細胞分化的藥物。cTnT是心肌肌鈣蛋白中具有較高特異性的亞型，是鑒定心肌源性細胞的特異性標志物［9，10］，本研究采用5－aza對 MSCs進行誘導培養(yǎng)，并采用免疫組織化學染色鑒定cT－nT的表達。研究顯示5－aza誘導培養(yǎng)組MSCs生長狀態(tài)良好，7d后細胞的形態(tài)出現變化，多緊密平行排列生長，體積變大，隨著培養(yǎng)時間的延長梭形細胞的比例下降，多呈桿狀，少數細胞呈不規(guī)則外形，相鄰細胞間的胞膜有接觸，排列具有方向性，逐漸相連呈肌管狀。誘導組在7d、14d、21d、28dMSCs的cTnT均呈陽性表達，cTnT表達隨誘導培養(yǎng)時間延長表達逐漸增強；未經5－aza誘導MSCs中未見cTnT表達。

綜上所述，本研究從臍帶血中成功分離高純度和活性的MSCs，并采用5－aza定向誘導分化為心肌細胞，為進一步應用臍帶血MSCs治療心血管疾病實驗奠定了基礎，相關研究正在深入進行中。

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