仇建標(biāo)，丁文勇，陳少波,3，等

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江溫州 325005；2.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點實驗室，浙江溫州 325005；3.溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035)

紅樹林是一種熱帶、亞熱帶特有的海岸帶植物群落。它生長于陸地與海洋交界帶的灘涂，是陸地向海洋過度的特殊生態(tài)系統(tǒng)。由于紅樹林生長在陸海交界處，是陸地的天然屏障，對減少臺風(fēng)等自然災(zāi)害造成的破壞有重要的意義[1]；紅樹林生態(tài)系統(tǒng)還具有吸收積累重金屬元素、清除有機(jī)氯農(nóng)藥改善環(huán)境質(zhì)量的作用；能凈化水體過濾陸地徑流和內(nèi)陸帶出的有機(jī)物質(zhì)和污染物，降解污染物[2]；在多樣性保護(hù)方面，它為許多海洋動物、鳥類提供棲息和覓食的理想生境，保護(hù)生物多樣性和防治病蟲害，素有“海底森林”、“水上綠洲”和“潮汐森林”之稱，其生物資源量非常豐富，是至今世界上少數(shù)幾個物種最多樣化的生態(tài)系統(tǒng)之一[3]。同時，紅樹林生態(tài)系統(tǒng)還具有生態(tài)旅游、科學(xué)研究、文化教育等重要價值。另外，紅樹林植物還是重要的化工原料及藥物來源。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及人們對生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識的加強(qiáng)，紅樹林生態(tài)系統(tǒng)也越來越成為人們研究和開發(fā)的熱點，分子水平上對紅樹林植物的研究也越來越多[4～6]。但是，由于紅樹植物的特殊性，分子水平上的研究也存在一些難點，其中之一就是紅樹植物的DNA提取。DNA的分離提取是進(jìn)行植物分子生物學(xué)研究工作的基礎(chǔ)，DNA的提取效率和純度嚴(yán)重影響分子生物學(xué)實驗的結(jié)果，因此快速提取得到高純度的DNA，是分子生物學(xué)實驗成敗的關(guān)鍵因素之一[7]。

一般陸地植物的DNA提取方法已經(jīng)非常成熟，常見的有傳統(tǒng)的CTAB法、SDS法等。但紅樹植物因其細(xì)胞壁含有大量的單寧和多糖等物質(zhì)，使其DNA提取存在一定的難度。單寧是一種能與蛋白質(zhì)和其他化合物形成交聯(lián)能力的酚化合物，核酸提取過程中，大量的單寧能與蛋白質(zhì)結(jié)合，而且單寧與生物堿和多糖也可發(fā)生跟單寧與蛋白質(zhì)結(jié)合相似的復(fù)合反應(yīng)[8]；而大量多糖的存在，使得其與DNA形成共沉淀，從而影響了核酸的純度[9]。目前國內(nèi)外最常采用的除多糖的方法是采用經(jīng)典的CsCl超速離心的方法，但此方法對實驗設(shè)備和操作技術(shù)要求較高，而且花費較高[10]。也有研究人員采用諸如柱過濾等純化方法[11]，雖然較好地純化了基因組DNA，但在純化過程中易造成基因組DNA的損失和斷裂，不能夠滿足如酶切連接等對DNA具有高要求的操作。本文通過比較6種不同的DNA提取方法，采用紅樹植物秋茄Kandelia candel為實驗材料，并用新鮮的的美人蕉Canna indica葉片材料作為對照，探索適合于紅樹植物DNA提取的方法。

1 材料與方法

1.1 材料：

1）新鮮的美人蕉葉片（標(biāo)記為M）；

2）干制的紅樹植物秋茄葉片樣本（標(biāo)記為Q）。

1.2 方法

分別采用以下6種方法，提取美人蕉和秋茄2種材料的基因組DNA。并記錄實驗過程中觀察到的溶液顏色及沉淀形態(tài)變化。實驗材料統(tǒng)一稱取0.2 g組織，提取產(chǎn)物統(tǒng)一用0.1 mL TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA）溶解。6種方法的實驗結(jié)果分別以M1、M2……M6和Q1、Q2……Q6標(biāo)示。

方法1：改良SDS法[12]

1）稱取0.2 g樣本用液氮研磨成粉，加入1 mL提取液（500 mmol/L NaC1，50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，50 mmol/L EDTA，2% β-巰基乙醇）室溫數(shù)分鐘解凍后加入0.5 mL 10%SDS溶液，輕輕混勻于65℃保溫30 min；

2）取出后立即置于冰上，加0.24 mL 5 mol/L KAc溶液于冰上反應(yīng)30 min；10 000 g，4℃離心20 min；取上清液加1倍體積的異丙醇，-40℃放置30 min；10 000 g，4℃離心20 min；

3）用0.5 mL TE緩沖液溶解沉淀，加等體積的氯仿-異戊醇（24:1），混勻；10 000 g，4℃離心10 min；

4）取上清液加0.8倍體積-20℃預(yù)冷的異丙醇和1/10體積的3 mol/L NaCl，-20℃靜置30 min沉淀DNA；10 000 g，4 ℃離心 20 min；

5）70%的乙醇洗滌DNA沉淀2次，風(fēng)干后溶于0.1 mLTE，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

方法2：高鹽低pH法[13-14]

1)稱取0.2 g樣本用液氮研磨成粉，加入1 mL 65℃預(yù)熱的提取液（100 mmol/L醋酸鈉，50 mmol/L EDTA，500 mmol/L 氯化鈉，3%SDS，1% β-巰基乙醇 pH 5.5）充分混勻于 65 ℃中保溫 30 min；10 000 g，4℃離心10 min；

2)取上清液加2/3倍體積的2.5 mol/L（pH=4.8）的KAc溶液，4℃放置15 min；10 000 g，4℃離心10 min；

3)取上清液加等體積的氯仿-異戊醇（24:1），10 000 g，4℃離心20 min；

4)取上清液加等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，-20℃靜置20 min沉淀DNA；10 000 g，4℃離心10 min；

5)用70%的乙醇洗滌DNA沉淀2次，風(fēng)干后溶于0.1 mL TE緩沖液。

方法3：傳統(tǒng)的CTAB法[15]

1)稱取0.2 g樣品用液氮研磨成粉，加入1 mL預(yù)熱的CTAB抽提液（2%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl pH8.0，20m mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% β-巰基乙醇），充分混合，于 65 ℃溫浴 10～60 min，不時混勻。

2)用等體積的氯仿-異戊醇（24:1）抽提勻漿液，顛倒混合，10 000 g，4℃離心10 min。

3)取上清，加入1/10體積65℃ CTAB/NaCl，顛倒混勻，用氯仿-異戊醇（24:1）抽提，離心回收上清。

4)加入等體積CTAB沉淀液，顛倒混勻，2 700 g，4℃離心5 min。移出上清，用TE緩沖液重懸沉淀。加入0.6倍體積的異丙醇沉淀核酸，充分混合，于10 000 g，4℃離心15 min。

5)用70%乙醇洗滌沉淀，風(fēng)干后溶于0.1 mL TE緩沖液。

方法4：“海刀豆DNA的提取”方法[16]

1）稱取0.2 g樣品置于冷研缽中（0～4℃冰?。┘尤? mL研磨緩沖液（0.45 mol/L NaCl，0.45 mol/L檸檬酸鈉，0.1 mol/L EDTA，1%SDS，pH 7.0），研磨成勻漿狀。

2）加入等體積飽和酚（1 mol/L Tris飽和重蒸酚，pH 8.0），溫和搖動10 min，以除去蛋白和使內(nèi)源DNase（DNA酶）失活。

3）2 500 g，室溫離心 10 min，取上清液加 2 倍體積氯仿-異戊醇（24:1），溫和搖動 10 min；2 500 g，室溫離心10 min，收集上層清液。反復(fù)抽提至界面無蛋白為止。

4）加2倍體積-20℃冰冷乙醇沉淀DNA，置于-20℃冰箱過夜，10 000 g，4℃離心10 min，沉淀溶于0.5 mL TE緩沖液，得到粗DNA溶液。

5）往粗DNA液中加滅活的DNase液（RNase溶于0.15 mmol/L NaCl，pH 5.0），終濃度為50 mg/mL，30℃，保溫 10 min，除 RNA。

6）加氯仿-異戊醇除蛋白（同3），乙醇沉淀DNA后，10 000 g，4℃離心10 min，風(fēng)干后沉淀溶于0.1 mL TE緩沖液。

方法5：常用改良的CTAB法[17]

1）稱取0.2 g樣品，用液氮研磨成粉，加1 mL CTAB抽提緩沖液（2%CTAB，0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% β-巰基乙醇），64 ℃保溫 30～60 min，并每 10 min 左右翻轉(zhuǎn) 1次。

2）在上述樣品中加入等體積Tris-酚和氯仿-異戊醇（24:1），充分混合，10 000 g，4℃離心10 min。

3）取上清，加等體積的CI，10 000 g，常溫離心10 min。

4）取上清，加1/5體積3 mol/L NaAc溶液和2倍體積的95%冰冷乙醇，輕微混勻后于-20℃條件下沉淀40 min以上。沉淀后10 000 g，4℃離心10 min。

5）用70%乙醇洗滌沉淀，風(fēng)干后溶于0.1 mL TE緩沖液。

方法6：針對紅樹植物優(yōu)化的CTAB法

1）稱取0.2 g樣品用液氮迅速充分研磨成粉末，加入1 mL預(yù)熱的2%CTAB抽提液（2%CTAB，0.1 mol/L tris-HCl pH8.0，20 m mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，1% β-巰基乙醇，2%PVP）。

2）放入水浴鍋中 55℃溫浴45 min～90 min，并每隔10 min輕輕顛倒搖晃1次，使其充分混合；加入少量 Rnase（RNA酶），37℃保溫1～2 h處理；加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1），充分混合，于10 000 g，4 ℃離心10 min。

3）取上清，加入0.5倍體積預(yù)熱的2%CTAB抽提液，再加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1），充分混合，10 000 g，常溫離心 10 min。

4）取上清，加入1/5體積5 mol/L NaCl，并加入2/3體積的冰冷異丙醇，輕輕搖晃混合，-20℃條件下放置90 min以上沉淀DNA，10 000 g，4℃離心10 min。

5）棄上清，回收沉淀，用70%乙醇充分洗滌，風(fēng)干后溶解于0.1 mL TE緩沖液。

1.3 總DNA的定性和定量檢測

以1 Kbp DNA Ladder Marker為參照，用1%的瓊脂糖凝膠電泳做定性分析。將提取的DNA樣品做稀釋100倍后，用紫外分光光度法分別測定OD260，OD280值并計算OD260/OD280以檢驗純度。

1.4 重復(fù)實驗

選用DNA提取效果較好的方法，進(jìn)行重復(fù)實驗，并采用其它紅樹植物材料進(jìn)行DNA提取，驗證其DNA提取效果。

2 研究結(jié)果

2.1 實驗過程中觀察結(jié)果的比較

從表1可知：不同的DNA提取方法對同一種植物的DNA抽提效果不同[18]，本實驗中方法6的抽提效果最明顯，抽提后顏色為無色，而其他方法除方法5對新鮮美人蕉材料抽提后顏色為無色外，抽提后都有一定的顏色，說明有葉綠素等蛋白存在。其中以方法1、方法2和方法4顏色最深，表明蛋白質(zhì)含量較多，抽提效果較差。沉淀物的顏色和形狀也與抽提效果具有一致性，方法6沉淀后為少量白色絮狀沉淀，表明提取效果較好。方法5中新鮮美人蕉材料沉淀后也為少量白色絮狀沉淀，而干制的秋茄葉片樣本沉淀后為少量淺黃膠狀沉淀，表明方法5對新鮮的一般植物材料提取效果較好，但是對含有較多多糖和單寧的干制紅樹植物樣本提取效果欠佳。其他幾種方法所得沉淀中均含有較多有色的雜質(zhì)，提取效果不是非常理想。

表1 不同提取方法實驗過程中的顏色及形態(tài)變化Tab.2 Changes of the colors or shapes during the experiment with different methods

2.2 電泳檢測結(jié)果比較

根據(jù)電泳結(jié)果（圖1）：除方法1外，其他5種方法從新鮮美人蕉材料中提取得到DNA都有條帶，方法6所得條帶的亮度最大；而從干制的秋茄葉片樣本提取的DNA只有方法3、方法5和方法6有條帶，而且方法3和方法5的條帶亮度都很微弱，只有方法6所得DNA條帶較亮。由此可見，方法6所提取DNA的效果最好。

2.3 紫外分光光度法測定結(jié)果比較

DNA溶液的純度用OD260/OD280的比值來表示，當(dāng)OD260/OD280比值接近1.8時，DNA純度符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)OD260/OD280比值大于1.9時，表明有RNA污染，小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染[19-20]。根據(jù)本實驗中紫外分光光度分析（表2）：方法1中Q1吸光比值較為異常（0.943 1，遠(yuǎn)小于1.6），可能是因為提取的DNA含有較多的蛋白質(zhì)、多糖或酚等雜質(zhì)，用TE溶解DNA后顏色依然較深，從而導(dǎo)致吸光比值異常。M3、Q6、M6吸光比值較接近1.8，表明所提取的DNA質(zhì)量較好。方法6所提取的DNA的OD260/OD280比值接近1.8，表明所提取的DNA質(zhì)量較好。

圖1 用6種方法提取的基因組DNA電泳圖片F(xiàn)ig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA by 6 methods

表2 6種方法所得DNA樣品的純度Tab.2 The purity of extracted DNA by 6 methods

2.4 重復(fù)實驗結(jié)果

采用方法6對秋茄材料進(jìn)行10次重復(fù)實驗，并采用其它紅樹植物材料木欖Bruguiera gymnoihiza、桐花Aegiceras corniculatum、白骨壤Avicennia marina進(jìn)行DNA提取效果的比較，電泳檢測結(jié)果（圖2）表明：用方法6提取的秋茄DNA純度較好，提取效果穩(wěn)定、可靠，并適用于其它紅樹植物DNA的提取。

圖2 方法6提取的基因組DNA電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA by Method 6

3 討論

3.1 選材

實驗材料的選擇是實驗過程的第一步，不同的植物用相同提取方法其DNA純度和提取率不同，同一植物用不同方法其提取其結(jié)果也不一樣[18,20]。采用同一植物的不同部位提取的DNA純度和提取率也不盡相同，一般含較多多糖和單寧的鹽生植物如紅樹植物，取材時應(yīng)盡量選取處于生長旺盛期的幼嫩組織[21-22]。

本實驗中選擇美人蕉作為實驗對照，美人蕉是一種常見的多年生進(jìn)立草本植物，所含單寧和多糖的量較少，在一般植物DNA提取上具有代表性。而且，選取的美人蕉材料為新鮮幼嫩的葉片，而秋茄為干制的成熟葉片。由實驗結(jié)果可知：除方法1外，其它方法提取美人蕉的DNA都有條帶，表明常規(guī)提取方法對普通植物都是有效的；而對于秋茄，只有方法6提取效果較好，其它方法都欠佳，表明常規(guī)提取方法難以從含有大量多糖和單寧的植物中可靠地提取出高質(zhì)量的DNA。而方法6的提取結(jié)果表明了其除多糖的效果較好，即使在無法獲得新鮮幼嫩材料時，也可以從成熟的紅樹植物葉片中提取得到高質(zhì)量的DNA。

3.2 雜質(zhì)分離

在DNA的提取過程中，雜質(zhì)的去除是得到高純度DNA的關(guān)鍵。實驗操作過程中顏色的變化能夠在一定程度上反映出雜質(zhì)去除的效果。本實驗列出了抽提后和沉淀后的顏色變化，對比電泳和紫外分光光度檢測結(jié)果可得：抽提后和沉淀后顏色較深表明雜質(zhì)去除的效果較差，顏色較淺表明明雜質(zhì)去除的效果較好。方法6提取過程中顏色最淺，表明其分離雜質(zhì)的效果最好。

比較6種方法，只有方法6中加入了2%體積的PVP。PVP是一種抗氧化劑，它的主要作用有：與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物，有效去除酚化合物；并且能與多糖結(jié)合，使多糖在抽提過程中與DNA分離[23-25]。這對于含有較多酚化合物（如單寧）和大量多糖物質(zhì)的紅樹植物干制材料具有非常明顯的去除酚和多糖的效果。

方法1～方法5提取得到的DNA因含有大量的多糖和DNA的復(fù)合物，從而呈現(xiàn)凝膠狀，對后續(xù)實驗將造成很大的影響。方法6中加入了1/5體積5 mol/L NaCl進(jìn)行高鹽沉淀。利用高鹽緩沖條件下，在異丙醇中DNA優(yōu)先沉淀的性質(zhì)，達(dá)到使DNA與多糖分離的目的，因而在含有大量多糖的紅樹植物DNA提取過程中，加入5 mol/L NaCl能夠有效地去除多糖的影響[26～28]。

此外，方法6中將傳統(tǒng)的酚：氯仿抽提法加入等體積的Tris飽和酚換成加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）。酚具有較強(qiáng)的變性作用，能夠除去蛋白質(zhì)，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10%～15%的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA。而且酚易氧化，氧化后容易降解DNA。因而用氯仿-異戊醇（24:1）代替Tris飽和酚能夠提高DNA的得率。而且氯仿-異戊醇比Tris飽和酚毒性小，使實驗過程更具安全性。

方法1為傳統(tǒng)的SDS法，在動植物DNA的提取中都有所應(yīng)用，但是在動物DNA提取中應(yīng)用較為廣泛。在本實驗中，方法1的DNA提取效果較差，可能原因是：1）SDS對蛋白質(zhì)的去除效果較好，但是對植物中復(fù)雜的多糖和單寧的去除效果不夠好；2）沉淀后用TE溶解再抽提，DNA損失較多，對DNA提取得率影響較大，因此秋茄和美人蕉樣品都未能提出DNA。

方法2、方法3和方法5都沒有專門除多糖的步驟，所以對紅樹植物的DNA提取效果都欠佳。而方法4是針對紅樹植物海刀豆的提取方法，其使用的研磨緩沖液主要成分是檸檬酸鈉，能較干凈地去除蛋白質(zhì)[16]，但是其對多糖的去除效果不好。而且與方法1類似，其沉淀后用TE溶解再抽提，對DNA造成的損失較大。

4 小結(jié)

通過6種不同的DNA提取方法的比較可知：自行改進(jìn)的CTAB法（方法6）最適合紅樹植物DNA的提取。方法6通過PVP的除酚去多糖作用，利用CTAB提取液和氯仿-異戊醇強(qiáng)效除蛋白和脂類物質(zhì)，結(jié)合高鹽沉淀除去多糖，以及異丙醇高效沉淀DNA，最終較徹底去除雜質(zhì)，得到高純度的基因組DNA。方法6還解決了實驗取材的限制，在無法滿足新鮮幼嫩材料時，也可以采用干制的材料提取得到較好的DNA。而且通過重復(fù)實驗，得到的DNA條帶電泳檢測結(jié)果都較好，說明此方法較可靠、穩(wěn)定。通過用此方法對其它種類紅樹植物材料進(jìn)行DNA提取，得到的DNA條帶電泳檢測結(jié)果也都較好。加上此方法操作簡單，安全快速，綜上說明方法6是一種適合于紅樹植物DNA提取的方法。

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