陳小平 張 茜

（連云港市第二人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222023）

重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(Endostar, 恩度)是一種新型的多靶點(diǎn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制劑，能有效的抑制腫瘤血管的生成，臨床用于多種腫瘤的治療[1]。研究顯示，恩度能特異性的作用于腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制血管生成，抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、遷移。隨著環(huán)境污染的加重(如PM2.5、PM10.0)、吸煙等因素的影響[2]。肺癌已占據(jù)腫瘤患者的發(fā)生率和病死率的首位。在臨床治療中，恩度常用于肺癌的治療。目前文獻(xiàn)報(bào)道多集中對(duì)恩度調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、促血管生成素1、2(Ang1、2)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等表達(dá)的影響[3]。但對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究較少。因此，在本研究中，將建立非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)體外共培養(yǎng)體系，探討恩度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；超凈工作臺(tái) (ESCO公司，新加坡)；二氧化碳培養(yǎng)箱(長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司，湖南)；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青公司，批號(hào)：110213)、重組人血管內(nèi)皮抑制素 (恩度): 煙臺(tái)麥得津生物工程有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT)(美國(guó),Sigma公司)；Transwll遷移小室(直徑6mm，孔徑5μm，Corning)；Bax，Bcl-2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。O-(氯乙酰-氨甲?；?煙曲霉醇(TNP-470，日本Osaka Takeda公司產(chǎn)品)。AnnexinV2FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物公司)。鏈霉親和生物素酶復(fù)合物(SABC)試劑盒購(gòu)自武漢博士得。酶聯(lián)分析儀為SPECTRAmax190 (Moleculor Devices, USA)；熒光顯微鏡 (Olympus IX71倒置熒光顯微鏡奧林巴斯BX51，日本)。其余試劑為商業(yè)來源的分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞和HUVECs細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和HUVECs細(xì)胞，分別以0.25%胰酶-0.01%EDTA消化，加入RPMI-1640培養(yǎng)基分別制備成2×104細(xì)胞/mL的A549單細(xì)胞懸液和1×105細(xì)胞/mL的HUVECs單細(xì)胞懸液，將6孔板Transwell 小室的下室接種上HUVECs，上室接種上A549細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基 (100 U/mL青霉素和 100 U/mL鏈霉素培養(yǎng))，以保證上室的細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中。將Transwell板置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 恩度共培養(yǎng)體系中對(duì)HUVECs生長(zhǎng)抑制作用

待下室HUVECs長(zhǎng)至75%～85%融合度時(shí)，將細(xì)胞以含藥培養(yǎng)基處理。恩度的濃度分別為10、20、40、80、100μg/mL，空白對(duì)照組加100μL培養(yǎng)基代替，陽(yáng)性對(duì)照組以TNP-470(終濃度25μg/mL)，另設(shè)本底對(duì)照孔(等體積含相應(yīng)濃度藥物的無細(xì)胞培養(yǎng)液)，每組設(shè)3個(gè)平行孔。待孵育48h后，棄去每孔的含藥血清，重新加入1mL不含血清的培養(yǎng)基，另加入MTT液(5 mg/mL)20μL，培養(yǎng)箱中孵育4h，棄去液體，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100μL，于震蕩器中振蕩10min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀580nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。生長(zhǎng)抑制率按以下公式計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組OD值—實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定HUVECs凋亡

按1.2.2項(xiàng)下接種細(xì)胞，并給予藥物。藥物處理并培養(yǎng)48h后，根據(jù)下述步驟采用Annexin V-FITC試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡：將下室HUVECs細(xì)胞以胰酶-EDTA消化，收集細(xì)胞，以培養(yǎng)基終止消化。每個(gè)樣本至少計(jì)數(shù)1×104細(xì)胞。將收集的細(xì)胞以冷的 PBS潤(rùn)洗2遍，以500μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5μLAnnexin V- FITC，輕微混勻；測(cè)定前加入5μLPI并置于暗處避光反應(yīng)15min。上機(jī)測(cè)定。每組平行2個(gè)樣本。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)恩度對(duì)HUVECs中Bcl-2和Bax凋亡蛋白的影響

以鏈霉親和生物素酶復(fù)合物(SABC)方法評(píng)價(jià)恩度對(duì)共培養(yǎng)體系中HUVECs的Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響。HUVECs接種在玻片上。恩度的濃度為10、20和40μg/mL。其他細(xì)胞接種和給藥同1.2.2項(xiàng)下操作。待培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞用PBS洗3次，每次1min；4%多聚甲醛室溫下固定90min，PBS 清洗標(biāo)本 3次，每次2 min；0.5% Triton X-100孵育20min，PBS洗滌3次，每次2min；以H2O2處理30min；PBS 洗滌3次，每次2min；然后以10%封閉血清孵育37℃20min。加入Bcl-2(1∶200)和Bax(1∶200)抗體37 ℃下孵育；120min后，加入二抗，孵育20min；PBS洗滌，以SABC溶液處理樣本。最后，以3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB，0.3mg/mL)處理，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蘇木素輕度復(fù)染，PBS洗滌，中性樹膠封片。鏡下Image-ProPlus圖像分析軟件拍片。陰性對(duì)照組以PBS替代一抗。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白

細(xì)胞接種和給藥同1.2.4項(xiàng)下操作。以胰酶-EDTA消化并收集細(xì)胞，加入冰冷PBS潤(rùn)洗3次，然后加入400μL 裂解液，置于冰上裂解細(xì)胞30min。于4℃離心機(jī)中14000rpm 離心5min，提取上清液，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜。以含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST室溫下封閉1h，加入Bcl-2與Bax抗體，4℃搖床過夜。加入HRPIgG 二抗(1∶1000)雜交，洗膜后顯色。置于凝膠成像系統(tǒng)中分析Bax和Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。以O(shè)ne-way ANOVA方差分析對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異比較。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 恩度抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖

恩度對(duì)HUVECs生長(zhǎng)抑制率隨著濃度的升高逐漸升高，10μg/mL恩度的生長(zhǎng)抑制率為(8.19±2.04)%，100μg/mL恩度的生長(zhǎng)抑制率為(65.13±3.78)%。陽(yáng)性對(duì)照25μg/mLTNP-470對(duì)HUVECs的生長(zhǎng)抑制率為37.56±7.22%(表1)。結(jié)果表明，恩度具有較強(qiáng)的抑制HUVECs細(xì)胞增殖活性。

表1 恩度對(duì)HUVECs增殖抑制作用

2.2 恩度誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

恩度處理48h后，10、20、40、80、100μg/mL濃度的恩度的凋亡率分別為(5.29±1.21)%、(8.33±0.62)%、(14.81 ±0.77)%、(21.87±0.96)%、(26.15±1.06)%(表2)。研究結(jié)果表明，在A549與HUVECs共培養(yǎng)體系中，恩度對(duì)HUVECs 細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用。

表2 恩度誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞凋亡率 (n=3)

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定恩度調(diào)節(jié)凋亡蛋白表達(dá)

在給予10、20、40 μg/mL 恩度48h后，促凋亡蛋白Bad蛋白表達(dá)分別為（5.57±1.74）%、（6.26±2.34）%和（8.16±1.58）%；抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)分別為（12.33±2.18）%、（8.67±1.55）%和（6.39±2.14）%(表3)。結(jié)果表明，在共培養(yǎng)體系中，恩度上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，而降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。

表3 恩度對(duì)HUVECs中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 (n=3)

2.4 凋亡蛋白的Western blotting測(cè)定

Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，10、20、40μg/mL恩度對(duì)抑凋亡蛋白Bcl-2相對(duì)表達(dá)量分別為（0.46±0.06）%、（0.34±0.07）%、（0.27±0.05）%；對(duì)促凋亡蛋白Bax相對(duì)表達(dá)量分別為（0.25±0.09）%、（0.36±0.12）%、（0.48±0.11）%(表4)。實(shí)驗(yàn)組與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

表4 Western blotting測(cè)定恩度對(duì)HUVECs中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 (n=3)

3 討 論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，隨著環(huán)境污染的逐漸嚴(yán)重以及吸煙等因素的影響，肺癌的發(fā)生率和病死率已經(jīng)占據(jù)腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅人類健康和生存質(zhì)量。在臨床中，肺癌常發(fā)生轉(zhuǎn)移引發(fā)其他腫瘤。而在肺癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為都依賴新血管的生成。研究顯示，當(dāng)瘤塊及其轉(zhuǎn)移灶生長(zhǎng)至1～2mm以上時(shí)，需要進(jìn)一步生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，需要新生毛細(xì)血管提供氧和營(yíng)養(yǎng)[4]。因此，通過抑制肺癌的血管生成成為抑制肺癌轉(zhuǎn)移、抑制癌組織生長(zhǎng)的有效措施。

近些年來，被稱為“腫瘤饑餓療法”的抗腫瘤血管生成成為抑制肺癌瘤塊生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的有效途徑。恩度是國(guó)內(nèi)首例重組人血管內(nèi)皮抑制素，是通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移來抑制腫瘤新生血管形成。目前，研究最多的是抑制血管內(nèi)皮的生長(zhǎng)因子如VEGF等的表達(dá)以及抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。眾多研究表明，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡也是抑制血管生成的一個(gè)重要機(jī)制[5，6]。在本研究中，建立人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)共培養(yǎng)體系，探討恩度誘導(dǎo)HUVECs凋亡的作用及機(jī)制。本研究的結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)體系中，恩度能顯著抑制HUVECs的增殖，并促進(jìn)HUVECs的凋亡。

Bcl-2家族蛋白在血管內(nèi)皮的凋亡中扮演著重要的作用。Bcl-2家族包括抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Bad等。在正常細(xì)胞內(nèi)，抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白體系處于相對(duì)平衡狀態(tài)；但當(dāng)在處于因素的刺激下，這種平衡被打破，抑凋亡處于下調(diào)狀態(tài)，而促凋亡蛋白處于上升狀態(tài)[6]。本研究顯示，當(dāng)給予血管內(nèi)皮抑制劑恩度48h后，抑凋亡蛋白Bcl-2被顯著下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax被顯著上調(diào)。結(jié)果表明，在共培養(yǎng)體系中，恩度能通過調(diào)節(jié)凋亡因子促進(jìn)血管內(nèi)皮凋亡而抑制血管內(nèi)皮的生長(zhǎng)。

總之，我們的研究探討了恩度抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)的凋亡機(jī)制。這為恩度在臨床上的進(jìn)一步使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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