許建英 李洪秀 王鵬

本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠股部肌袋模型，以牛BMG為載體，旨在局部應(yīng)用rhBMP-2促進(jìn)成骨的基礎(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用不同濃度的辛伐他汀，來觀察二者之間的異位誘導(dǎo)成骨效應(yīng)，從而為探索辛伐他汀在成骨方面的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)(促進(jìn)、抑制或無作用)，是否能作為rhBMP-2在促進(jìn)成骨方面具有協(xié)同作用的激活物，亦為進(jìn)一步探索rhBMP-2在促進(jìn)成骨方面的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 雄性SD大鼠45只，遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 方法 將45只雄性SD大鼠隨機(jī)分成3組(表1)，A組:高劑量實(shí)驗(yàn)組(含15%辛伐他汀+rhBMP-2 0.25 mg);B組:低劑量實(shí)驗(yàn)組(含2.5%辛伐他汀+rhBMP-2 0.25 mg);C組:陽性對照組(含rhBMP-2 0.25 mg)。水合氯醛麻醉后，每

1.3 檢測指標(biāo)只大鼠右側(cè)股部去毛。常規(guī)消毒后暴露后股部肌袋。A、B、C組動物分別植入相應(yīng)載體。仔細(xì)縫合肌肉、皮膚，麻醉清醒后送回籠養(yǎng)。于術(shù)后15、30、60 d處死動物，每組每期5只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。

表1 實(shí)驗(yàn)動物分組情況

1.3.1 大體觀察 對術(shù)后第15、30、60天的SD大鼠進(jìn)行組織塊硬度、范圍及肢體運(yùn)動情況的觀察。

1.3.2 堿性磷酸酶檢測 將所取組織標(biāo)本清除多余肌肉，將其一半組織稱量濕重后(另一半用于組織學(xué)觀察)，進(jìn)行堿性磷酸酶(AKP)檢測。采用Wilkinson測定方法，測定AKP活性，再除以標(biāo)本濕重，即得AKP單位組織濕重的活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大體觀察 術(shù)后3組SD大鼠均有死亡，其中A組無死亡，B組死亡2只(術(shù)后2 d及6 d各一只)，C組死亡5只(術(shù)后第2天二只，第3天一只，第5天一只，第20天一只)，均按照相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件予以補(bǔ)充。術(shù)后第15天，各組于股后部植入處均可捫及新生硬組織;術(shù)后第30天，B組、C組新生硬組織范圍變大，硬度增加，A組則無明顯變化;第60天，B組、C組組織硬度及范圍進(jìn)一步增加，且C組組織硬度大于B組，A組硬度有所增加，但不及B、C兩組。

2.2 堿性磷酸酶檢測 AKP含量:三組組織標(biāo)本AKP含量均于術(shù)后30 d達(dá)到峰值。第15天A組、B組AKP含量顯著低于對照組AKP含量(P＜0.05)，A、B兩組間則無明顯差別;第30天，A組AKP含量明顯低于對照組(P＜0.01)和B組(P＜0.01)，B、C兩組間則無明顯差別;第60天，各組間AKP含量均無明顯差別，且含量均較低。(表3、圖3)

表2 標(biāo)本中AKP水平測定［IU/g(濕重)，()］

表2 標(biāo)本中AKP水平測定［IU/g(濕重)，()］

注:與對照組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別15 d 30 d 60 d A組 6.98±0.84* 17.65±0.58＊＊9.65±2.14 26.42±1.63 3.11±1.27 2.85±0.86 B組 7.14±1.56* 25.34±1.52 3.02±1.28 C組

3 討論

本實(shí)驗(yàn)三組動物實(shí)驗(yàn)中雖然含有相同劑量的rhBMP-2，但AKP表達(dá)量不同，說明是由于使用不同濃度的辛伐他汀所致。研究結(jié)果顯示，rhBMP-2可促進(jìn)成骨細(xì)胞AKP活性增加，術(shù)后15 dA組與B組雖可促進(jìn)成骨細(xì)胞AKP活性增加，但作用不及單用rhBMP-2組，術(shù)后30 dB組與C組有明顯的促進(jìn)作用而A組則無明顯的促進(jìn)AKP的作用。術(shù)后60 d各組間無差別，表達(dá)量都很低。表明局部高濃度的辛伐他汀可能會抑制成骨細(xì)胞分化成熟，而低濃度的辛伐他汀作用不明顯。各組實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AKP活性在術(shù)后15 d即有表達(dá)，于30 d達(dá)到高峰，而此時正是成軟骨和軟骨細(xì)胞出現(xiàn)的時間，這一結(jié)果和Sakano等［1］及 Bernard等［2］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這些結(jié)果提示骨形成開始于軟骨溶解之前。而且成軟骨細(xì)胞的增殖和AKP的表達(dá)結(jié)果也提示，在軟骨形成的早期即已開始了組織礦化的調(diào)節(jié)。30 d之后，雖然組織礦化仍在進(jìn)行，但AKP水平在下降。這提示，30 d之后，在新生骨組織中AKP仍然存在，而且發(fā)揮著鈣結(jié)合蛋白的作用［3］。說明軟骨形成期AKP的高表達(dá)是BMP誘導(dǎo)成骨中組織礦化的先決條件。

［1］Sakano S，Murata Y，Miura T.Collagen and alkaline phosphatase gene expression during bone morphogenetic protein induced cartilage and bone differentiation.Clin Orthopand Related Research，1993，292:337-344.

［2］Bernard B，Bianco P，Bonucci E.Biochemical and immuno-histochemical evidence that in cartilage an alkaline phosphatase is a Ca2+-binding glycoprotein.J Cell Biol，1986，103:1615-1618.

［3］McLean F M，Keller P J，Genge B R.Disposition of preformed mineral in matrix vesicles:Internal localization and association with alkaline phosphatase.J Biol Chem，1987，262:10481-10487.