張 峰，薛素萍，曲銀娥＊

（1.河北大學(xué)衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 保定071000；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是指內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外的部位，一般僅見于生育年齡婦女；子宮腺肌病（Adenomyosis，Ad）是指子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)侵入子宮肌層，多發(fā)生于40歲以上的經(jīng)產(chǎn)婦。EMs和Ad均為雌激素依賴性疾病，臨床上?？刹⒋妫l(fā)病機制及組織學(xué)發(fā)生不盡相同［1］。細胞色素P45017c羥化酶／17、20裂解酶由CYP17基因編碼，是雌激素代謝的關(guān)鍵酶，在一定程度上決定體內(nèi)雌激素水平。CYP17基因5＇非編碼區(qū)翻譯起始點－34bp處T－C單核苷酸多態(tài)與前列腺癌［2］和子宮內(nèi)膜癌［3］等疾病遺傳易感性有關(guān)，與內(nèi)異癥的關(guān)系目前尚存在爭議［4，5］。本文應(yīng)用PCR－RFLP技術(shù)，檢測了內(nèi)異癥、腺肌病和健康女性CYP17基因－34bp處T－C單核苷酸多態(tài)，旨在探討CYP17基因單核苷酸多態(tài)與內(nèi)異癥和腺肌病風(fēng)險的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2007年3月－2009年2月保定市第三醫(yī)院剖腹或腹腔鏡手術(shù)的61例子宮內(nèi)膜異位癥患者（內(nèi)異癥組）和59例子宮腺肌病患者（腺肌病組），所有病例均經(jīng)病理確診；選擇同期在此院體檢的健康女性65例為對照組。3組年齡分別為29.47±2.3歲、32.15±1.9歲、30.9±3.2歲，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有研究對象無血緣關(guān)系，月經(jīng)周期規(guī)律，無其他內(nèi)外科及內(nèi)分泌疾病，排除家族性遺傳疾病如糖尿病、高血壓等疾病，術(shù)前三個月無服用激素類藥物及免疫抑制類藥物。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶MspA1I、dNTP和TaqDNA聚合酶為美國Promega公司產(chǎn)品，PCR擴增試劑盒購自加拿大Sangon公司，CYP17引物由北京賽百盛公司合成，凝膠電泳成像系統(tǒng)為FUJI FILM公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取 清晨空腹采集5ml靜脈血，檸檬酸鈉抗凝，蛋白酶K消化－苯酚法提取外周血基因組DNA，－70℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)Genebank查詢的基因序列，用Primer 5軟件，設(shè)計1對特異性引物，由北京賽百盛公司合成。

上游：5′－CATTCGCACTCTGGAGTC－3′

下游：5′－AGGCTCTTGGGGTACTTG－3′

片段大小為419bp

1.3.3 PCR擴增體系及程序 25μl反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μl、去離子水17.3μl、上下游引物各5μl（20μM）、dNTPs 2μl、Taq聚合酶0.2μl（5U／μl）、模板 DNA 2μl（20ng／μl）。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，57℃退火1 min，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，末次循環(huán)后，72℃延伸5min，4℃保存。

1.3.4 酶切鑒定基因型 PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MspA1I于37℃酶切過夜，20μl酶切體系：10×NE buffer 2μl、雙蒸水12.3μl、PCR產(chǎn)物5μl、100×BSA 0.2μl、MspA1I0.5μl（10U／μl）。取10μl酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，確定基因型。隨機選擇CYP17 3種基因型PCR產(chǎn)物，送北京賽百盛公司測序驗證基因型。等位基因頻率＝（2×純合子數(shù)＋雜合子數(shù)）／（2×受檢人群）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，基因型和等位基因頻率采用基因直接計數(shù)法計算，χ2檢驗比較各組間基因型及等位基因頻率差異，非條件Logistic回歸計算比值比（OR）及95%可信區(qū)間（CI），確定基因型與內(nèi)異癥和腺肌病發(fā)生的關(guān)聯(lián)強度。

2 結(jié)果

2.1 CYP17基因MspA1I酶切后基因型檢測結(jié)果

PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，可見CYP17基因擴增片段為419bp；CYP17基因－34bp處的T－C堿基置換后，產(chǎn)生一個能被內(nèi)切酶MspA1I識別的位點，因此PCR產(chǎn)物經(jīng)MspA1I酶切后，可產(chǎn)生3種基因型：野生純和型（A1A1）無 MspA1I酶切位點，僅有419bp 1個片段；突變純和型（A2A2）含有1個酶切位點，被切割為295bp、124bp 2個片段；雜合型（A1A2）被切割為419bp、295bp和124bp 3個片段（圖1）。隨機選擇CYP17 3種基因型PCR產(chǎn)物進行測序驗證，顯示堿基改變與酶切結(jié)果相吻合。

圖1 CYP17基因型圖譜

2.2 CYP17基因單核苷酸多態(tài)與內(nèi)異癥和腺肌病的關(guān)系

內(nèi)異癥組和腺肌病組A1A1基因型頻率及A1等位基因頻率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；內(nèi)異癥組與腺肌病組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表1、表2）。3組基因頻率分布均符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡定律。

表1 3組CYP17基因型頻率比較（例數(shù)）

表2 3組CYP17等位基因頻率比較 （%）

2.3 CYP17各基因型的相對危險度分析

非條件Logistic回歸結(jié)果表明：A1A1和A1A2基因型的個體發(fā)生內(nèi)異癥的相對危險度（OR）分別是A2A2型個體的4.615倍和3.467倍，發(fā)生腺肌病的相對危險度分別是A2A2型個體的3.692倍和3.867倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示A1A1、A1A2基因型可能增加內(nèi)異癥和腺肌病發(fā)生的危險性，CYP17基因T－C單核苷酸多態(tài)與內(nèi)異癥和腺肌病風(fēng)險有關(guān)（表3）。

表3 CYP17 3種基因型相對危險度分析

3 討論

細胞色素P450c17α羥化酶／17、20裂解酶是雌激素合成代謝的關(guān)鍵酶之一，也是雌激素合成過程中的限速酶，介導(dǎo)類固醇17α羥化酶和17、20裂解酶活性，參與膽固醇前體向雄激素、雌激素或孕激素以及鹽皮質(zhì)激素或糖皮質(zhì)激素的轉(zhuǎn)化，由CYP17基因編碼。CYP17基因5′非編碼區(qū)翻譯起始點－34bp處有1個T－C單核苷酸突變，由于T－C的替換產(chǎn)生了限制性內(nèi)切酶MspA1I的酶切位點，產(chǎn)生Al和A2兩種等位基因，當(dāng)?shù)任换駻2存在時，理論上可以增加基因的轉(zhuǎn)錄效率，提高酶的活性，促進雄激素合成增多［6］。

研究中發(fā)現(xiàn)，A1A1、A1A2和A2A2基因型頻率及A1等位基因頻率在腺肌病組和內(nèi)異癥組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示腺肌病和內(nèi)異癥在CYP17基因T－C單核苷酸多態(tài)方面具有相似的發(fā)病機制；危險度分析顯示A1A1和A1A2基因型個體發(fā)生內(nèi)異癥的相對危險度分別是A2A2型個體的4.615倍和3.467倍，發(fā)生腺肌病的相對危險度分別是A2A2型個體的3.692倍和3.867倍，表明A1等位基因為內(nèi)異癥的高危險因素，A1A1和A1A2基因型為內(nèi)異癥和腺肌病的易感基因型。Hsieh等［4］發(fā)現(xiàn)CYP17基因的A1純合子等位基因增加內(nèi)異癥的危險性，李維麟等［7］發(fā)現(xiàn)攜帶A1等位基因的婦女患內(nèi)異癥的風(fēng)險可能更高，與我們的結(jié)論一致。Aban等［8－10］和 Garmer等［11］分別在對子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的研究中得到相似結(jié)論，而王曉莉［12］等發(fā)現(xiàn)CYP17基因啟動子區(qū)T－C多態(tài)與成都地區(qū)子宮肌瘤發(fā)病風(fēng)險無相關(guān)性。CYP17基因多態(tài)性增加內(nèi)異癥易感性的機制目前仍不清楚，推測可能由于CYP17基因5′端啟動子－34bp處的T－C點突變上調(diào)了CYP17基因表達，進而造成雄激素合成增多；同時，可能A1等位基因結(jié)合、代謝循環(huán)中的雌激素能力較低［13］，因此，A1A1和 A1A2基因型個體雌激素水平較高，發(fā)生內(nèi)異癥和腺肌病的危險增加，與臨床上絕經(jīng)后內(nèi)異癥和腺肌病病灶逐漸萎縮一致。

由于CYP17基因多態(tài)性具有明顯的地域和種族差異，且所選擇的內(nèi)異癥和腺肌癥患者的臨床分期、月經(jīng)周期等不同，加之基因間的相互作用，不同的研究可能得出不同的結(jié)論，尚需在不同人群中擴大樣本量進一步研究。

［1］樂 杰.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.第6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.354－361.

［2］Wright JL，Kwon EM，Lin DW，et al.CYP17polymorphisms and prostate cancer outcomes［J］.Prostate，2010，70（10）：1094.

［3］J Gao，YB Xiang，WH Xu，et al，A case－control study on genetic polymorphism of CYP17MspA（1）I and its association with endometrial cancer risk［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2007，29（4）：266.

［4］Hsieh YY，Chang CC，Tsai FJ，et al.Estrogen receptor alpha dinucleotide repeat and cytochrome P450c17alpha gene polymorphisms are associated with susceptibility to endometriosis［J］.Fertil Steril，2005，83（3）：567.

［5］Juo S.H，Wang T.N，Lee J.N，et al.CYP17，CYP1A1and COMT polymorphisms and the risk of adenomyosis and endometriosis in Taiwanese women［J］.Human Reproduction，2006，21（6）：1498.

［6］Kitawaki J，Kado N，Ishihara H，et al.Endometriosis：the pathophysiology as an estrogen－dependent disease［J］.Steroid Biochem Mole Biol，2003，83：149.

［7］李維麟.CYP17單核苷酸多態(tài)性的研究進展［J］.國際生殖健康／計劃生育雜志，2009，28（2）：118.

［8］Aban M，Arslan M，Tok E，et al.CYP17genetic polymorphism in patients with endometrial hyperplasia and cancer［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16（1）：448.

［9］劉 潔，楊興升.雌激素代謝基因CYP17和COMT單核苷酸多態(tài)與子宮內(nèi)膜腺癌風(fēng)險的關(guān)系［J］.山東大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2007，45（1）：18.

［10］Berstein LM，Imyanitov EN，Kovalevskij AJ，et al.CYP17and CYP19genetic polymorphisms in endometrial cancer：association with intratumoral aromatase activity［J］.Cancer Letters，2004，207（2）：191.

［11］Gamer EI，Erika EE，Berkowitz RS，et al.Polymorphisms of theestrogen metabolizing genes CYP17and catechol O methyltransferase and risk of epithelial ovarian cancer［J］.Cancer Res，2002，61（1）：3058.

［12］王曉莉，曾 靜，王 璟，等.雌激素代謝酶CYP17、CYP1A2基因多態(tài)性與子宮肌瘤易感性的關(guān)系［J］.中國婦幼保健，2011，26（27）：4201.

［13］Roberta MC，Heather SFe，Malcolm C，et al.Risk of Endometrial Cancer and Estrogen Replacement Therapy History by CYP17Genotype1［J］.Cancer Res，2001，61（2），848.