許仁帆 楊思思 曾月霞 ?；矍?張木勛

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢430030）

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）在發(fā)達(dá)國(guó)家是最常見的肝臟病理改變，與肥胖、糖尿病和代謝綜合癥密切聯(lián)系［1］。NAFLD是一個(gè)廣泛的疾病譜，發(fā)病率約為10－20%，包括單純脂肪變和非酒精性肝炎（NASH），并可以進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞性肝癌［2］。單純的脂肪變進(jìn)展為NASH的具體機(jī)制并不十分明確，其中最主要學(xué)說為“二次打擊”學(xué)說［3，4］。第一次打擊為代謝失衡，如胰島素抵抗（IR），從而導(dǎo)致過量甘油三酯在肝細(xì)胞中聚集和脂肪變性，第二次打擊主要包括氧化應(yīng)激和炎性因子，如TNF－α，IL－6等炎性因子在促進(jìn)肝細(xì)胞炎性壞死和星狀細(xì)胞纖維活性中起著重要的作用。

血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）為腎素－血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的主要肽，其Ⅰ型受體AT1分布在肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、HSC、成纖維細(xì)胞、枯否細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等［5］。AngⅡ與AT1相互作用，在調(diào)節(jié)肝臟的細(xì)胞生長(zhǎng)、炎癥和纖維化中起著重要的作用［6］。研究表明，AngⅡ能夠產(chǎn)生一些炎性因子，如IL－6，IL－1，TGF－β，TNF－α等［7，8］，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，且Ang II在多種細(xì)胞類型中均能激活前炎性轉(zhuǎn)錄因子如 NF－κB［9，10］。奧美沙坦，一種 AngⅡⅠ型受體阻斷劑（ARB），在一些研究認(rèn)為能夠減輕NAFLD模型中脂肪變［11］，但其具體機(jī)制并不十分明確。本實(shí)驗(yàn)的目的是探討奧美沙坦在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中的保護(hù)作用，尤其是對(duì)炎癥因子的影響。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們給予小鼠高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD模型后，奧美沙坦灌胃8w，觀察其對(duì)肝臟脂肪變的影響，Real－time PCR檢測(cè)肝臟炎性因子TNF－α和IL－6mRNA 的表達(dá)，并采 用 Western blot方法檢測(cè)IκB－α、p－IκBα、NF－κB信號(hào)通路的活化情況，初步探討奧美沙坦對(duì)NAFLD脂肪變和炎性改變的影響及可能機(jī)制。

材料和方法

1．實(shí)驗(yàn)材料及試劑

奧美沙坦購自上海三共制藥有限公司，辣根過氧化酶偶聯(lián)羊抗兔IgG抗體和SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印膜PVDF膜 購自Schleicher and Schuell公司，化學(xué)發(fā)光試劑ECL購自PIERCE公司，抗IκB－α、p－IκBα、β－actin、Lamin B 抗 體 購 自 Santa Cruz公 司，抗 NF－κB p65 抗 體 購 自 Cell Signal Technology公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol以及PCR引物購于寶生物工程（大連）有限公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型構(gòu)建

7周齡SPF級(jí)雄性C57BL／6小鼠，購買自北京華阜康公司。小鼠每籠4只，自由進(jìn)食和飲水，室溫20℃，晝夜交替12h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后隨機(jī)分為高脂組（n＝16）和正常飲食組（n＝8），高脂組小鼠高脂飲食（含60%的的脂肪）12w后再隨機(jī)分為高脂飲食對(duì)照組（n＝8），高脂飲食治療組（n＝8）。正常組（n＝8）給予正常飲食以及沒有處理的水；高脂飲食對(duì)照組（n＝8）給予高脂飲食（含60%的脂肪）和未處理的水。高脂飲食治療組（n＝8）給予高脂飲食（含60%的脂肪）并0．75mg／kg的奧美沙坦灌胃8w。分組后每周稱量食物攝入量，飲用水量以及體重，8w后處死小鼠。小鼠禁食12h后，眼眶內(nèi)眥取血1ml，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）。小鼠處死后迅速剪開腹腔，觀察肝臟形態(tài)。取出完整肝臟，部分用OCT包埋劑包埋制作冰凍切片行油紅染色，部分用福爾馬林固定以備形態(tài)學(xué)染色，其余標(biāo)本液氮速凍后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3．組織病理學(xué)觀察

各組小鼠肝臟用福爾馬林固定后石蠟包埋并制成4μm切片，HE染色觀察肝臟脂肪變性及炎癥變化。采用鏈霉親和素－生物素復(fù)合物技術(shù)SP法檢測(cè)F4／80表達(dá)，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說明，組化染色陽性呈棕黃色，在每張切片分別隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野（200×）攝片；計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)F4／80陽性的細(xì)胞數(shù)，取其均值作為衡量肝組織內(nèi)巨噬細(xì)胞表達(dá)的指標(biāo)。油紅O染色用以檢測(cè)冰凍切片上的脂肪分布。肝臟脂肪變的分度：0＝?jīng)]有，1＝肝細(xì)胞脂肪變低于33%，2＝肝細(xì)胞脂肪變?yōu)?3%－66%，3＝肝細(xì)胞脂肪變大于66%，光鏡下觀察結(jié)果［12］。

4．肝臟甘油三酯含量檢測(cè)

稱取100mg肝臟組織標(biāo)本加入1ml氯仿／甲醇（2∶1）混合液中，1500r／min 電動(dòng)勻漿器勻漿5min，制備10%的肝組織勻漿。勻漿移入干凈試管中，在室溫下?lián)u動(dòng)過夜，然后加入1ml 0．6%的氯化鈉混勻，2000r／min離心15min分離有機(jī)相和無機(jī)相，底層的氯仿層小心移入玻璃管，用氮?dú)獯蹈珊笤偃苡谶m量乙醇中，用甘油三酯測(cè)定試劑盒（南京建成）測(cè)出甘油三酯含量。

5．實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝臟中TNF－α和IL－6mRNA的表達(dá)

每只小鼠的肝臟組織均取50mg，按Trizol試劑盒提供的方法，提取總RNA，取RNA溶液用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和含量，取總RNA 5μg由逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA。用β－actin基因作為內(nèi)參，2－△△CT值表示基因相對(duì)表達(dá)量。TNF－α基因上游引物序列為：5’－TTCCTGATCGTGGCAGGCGC－3’，下游引物序列：5’－CAGCTCCACGCCATTGGCCA－3’。IL－6基因上游引物序列為：5’－AGCGCCTTCGGTCCAGTTGC－3’，下 游 引 物 序 列：5’－TGCCAGTGCCTCTTTGCTGCT－3’。β－actin基因上游引物序列為：5’－AGAGGGAAATCGTGCGTGAC－3’，下 游 引物序列：5’－CAATAGTGATGACCTGGCCGT－3’。

6．Western blot檢測(cè)

分別提取小鼠肝臟組織的總蛋白和核、漿分離蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定濃度。每只均提取20μg蛋白質(zhì)，上樣到10%SDS PAGE凝膠電泳，所用轉(zhuǎn) 膜 緩 沖 液 為 Tris HCl 125mmol／L，甘 氨 酸192mmol／L和20%甲醇，在4℃條件下用25V電壓維持10h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜在含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中封閉2．5h后放入含有IκB－α、p－IκBα、NF－κB p65、β－actin、Lamin B抗體的抗體稀釋液中4℃孵育過夜，第二日TBST于室溫下洗膜6次，每次10min，加入辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（1∶5000），室溫下?lián)u動(dòng)孵育2h，TBST室溫下同法洗膜6次，加入ECL試劑顯色曝光。最后IBAS圖像處理。系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行掃描并測(cè)定感光區(qū)帶的感光密度積分處理相對(duì)吸光度值（IOD）。

7．統(tǒng)計(jì)與分析

所有的數(shù)據(jù)均用mean±SD表達(dá)。各參數(shù)之間的差異顯著性應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13．0進(jìn)行ANO－VA檢驗(yàn)，P＜0．05被認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．奧美沙坦對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD肝功能的影響

高脂飲食喂養(yǎng)20w后，與普通飲食組小鼠相比，高脂飲食對(duì)照組小鼠飲食量無明顯變化，奧美沙坦治療8w后明顯降低高脂飲食小鼠的飲食量。高脂飲食對(duì)照組小鼠飲用水量及體重較正常飲食組小鼠明顯增加，奧美沙坦治療8w后明顯降低了高脂飲食引起的飲用水量及體重的增加（P＜0．05；表1）。高脂飲食對(duì)照組小鼠肝功能的ALT、AST數(shù)值分別為102±13．4、133±14．6U／L，較正常飲食組小鼠ALT、AST數(shù)值43．6±7．1、62．8±8．7U／L明顯升高，而奧美沙坦治療8w后肝功能ALT、AST數(shù)值為72．2±10．6、95．6±12U／L，顯著降低了高脂飲食誘導(dǎo)的肝功能失常（P＜0．05；表1）。

表1 各組小鼠的體重及肝功能Table 1 Physiological parameters of body weigh and liver function in mice

2．奧美沙坦對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD肝臟脂肪變的影響

油紅染色顯示正常飲食組肝細(xì)胞無脂肪變性，偶爾可見散在脂滴。高脂誘導(dǎo)20w后（高脂飲食對(duì)照組）小鼠呈現(xiàn)重度脂肪變，特點(diǎn)為彌漫性大小脂肪泡混合存在，以大泡為主。奧美沙坦治療8w后（高脂飲食治療組）肝細(xì)胞脂肪變明顯減輕，多為輕到中度，且脂肪變的面積明顯減少（P＜0．05；圖1A－C）。普通飲食組肝臟甘油三酯的含量為7．37±0．70mg／g，高脂飲食對(duì)照組為28．64±2．62mg／g，而高脂飲食治療組12．63±1．42mg／g，明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖1D）。普通飲食組的脂肪評(píng)分為0．13±0．35，高脂飲食對(duì)照組的脂肪評(píng)分為2．75±0．46，而高脂飲食治療組的脂肪評(píng)分明顯減少，為1．63±0．51，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05，圖1E）。

圖1 奧美沙坦顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟脂肪變。（A－C）各組小鼠肝臟冰凍切片分別行油紅O染色（×100）。（A：普通飲食組；B：高脂飲食對(duì)照組；C：高脂飲食治療組。）（D）各組小鼠油紅0染色的切片行脂肪變分級(jí)。（E）各組小鼠肝臟甘油三酯含量比較。

3．肝臟炎性改變

肝臟HE染色顯示，正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝竇清晰可見，肝索排列整齊，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。高脂飲食對(duì)照組小鼠呈現(xiàn)出中到重度的炎癥，表現(xiàn)為匯管區(qū)和小葉間的大量單核細(xì)胞和多核巨細(xì)胞聚集，以及局部肝細(xì)胞壞死。高脂飲食治療組炎性病變明顯減輕，僅肝小葉少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2AC）。免疫組化染色顯示，高脂飲食治療組中F4／80陽性細(xì)胞（代表肝巨噬細(xì)胞即枯否細(xì)胞）的數(shù)目明顯低于高脂飲食對(duì)照組（圖2D－G）。

圖2 奧美沙坦顯著改善HFD誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)。（A－C）各組小鼠肝臟石蠟切片行HE染色。（D－F）各組小鼠肝臟石蠟切片行免疫組織化學(xué)染色（F4／80），顯示巨噬細(xì)胞表達(dá)。（G）各組小鼠免疫反應(yīng)F4／80陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（A、D：普通飲食組；B、E：高脂飲食對(duì)照組；C、F：高脂飲食治療組。）Fig．2Olmenstartan reduced high fat diet－induced liver inflammation．（A－C）Histological analysis of inflammation in liver HE sections（×200）．（D－F）Representative pictures of immunohistochemical detection of F4／80expression in liver from each treatment group（×200）．（G）Quantification of F4／80－positive cells in liver of each group．Data are shown as mean± SD （n＝8per group）．1：normal control diet mice；2：high fat diet control mice；3：high fat diet treatment mice．＊P＜0．05vs．normal control diet mice；＃P＜0．05vs．high fat diet control mice．

4．肝組織TNF－αmRNA和IL－6mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，在肝臟中，TNF－αmRNA和IL－6mRNA等促炎癥細(xì)胞因子的水平在高脂飲食治療組的相對(duì)表達(dá)分別為4．21±0．39和1．37±0．10，明顯低于高脂飲食對(duì)照組，其TNF－αmRNA和IL－6mRNA的相對(duì)表達(dá)分別為1．88±0．15和2．89±0．25，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05；圖3）。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝臟炎癥因子表達(dá)。（A）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠肝臟中TNF－αmRNA水平。（B）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組小鼠肝臟中IL－6mRNA水平。數(shù)據(jù)由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。1：普通飲食組；2：高脂飲食對(duì)照組；3：高脂飲食治療組。＊P＜0．05與正常組比較，＃P＜0．05與高脂飲食對(duì)照組比較。Fig．3Real－time PCR were performed to evaluate the levels of inflammation factor in liver from each group．（A）Hepatic TNF－αmRNA expression；（B）Hepatic IL－6mRNA expression．The density values were normalized toβ－actin．Data are shown as mean± SD （n＝8per group）．1：normal control diet mice 2：high fat diet control mice；3：high fat diet treatment mice．＊P＜0．05vs．normal control diet mice；＃P＜0．05vs．high fat diet control mice．

5．Western blot 檢 測(cè) 小 鼠 肝 臟 中IκB－α，p－IκBα，NF－κB p65蛋白的表達(dá)水平

與正常飲食組小鼠相比，高脂飲食組小鼠肝臟細(xì)胞質(zhì)中IκB－α蛋白表達(dá)明顯減少，p－IκBα蛋白表達(dá)明顯升高（圖4A），NF－κB p65在細(xì)胞核中表達(dá)明顯增加（圖4B）。奧美沙坦灌胃治療8w后能夠抑制高脂飲食誘導(dǎo)的IκB－α磷酸化和降解，阻抑 NF－κB p65核轉(zhuǎn)位，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05；圖4）。

圖4 奧美沙坦抑制NF－κB通路蛋白活化。（A）Western blot檢測(cè)各組小鼠肝臟IκBα和p－IκBα表達(dá)水平。（B）Western blot檢測(cè)各組小鼠肝臟核蛋白NF－κB p65亞單位表達(dá)水平。數(shù)據(jù)由均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。1：普通飲食組；2：高脂飲食對(duì)照組；3：高脂飲食治療組。＊P＜0．05與正常組比較，＃P＜0．05與高脂飲食對(duì)照組比較。Fig．4Olmenstartan prevents nuclear factor NF－κB activation．（A）Western blot of liver levels of IκBα，p－IκBαfrom each treatment groups．（B）Western blot of nuclear protein levels of NF－κB from each treatment group．Data are shown as mean±SD （n＝8per group）．1：normal control diet mice；2：high fat diet control mice；3：high fat diet treatment mice．＊P＜0．05vs．normal control diet mice；＃P＜0．05vs．high fat diet control mice．

討 論

炎性因子為NASH“二次打擊”學(xué)說的重要組成部分，被認(rèn)為在NASH的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［2］。本實(shí)驗(yàn)的目的是探討ARB藥物，奧美沙坦對(duì)于高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型炎癥反應(yīng)的影響及相關(guān)機(jī)制。小鼠在高脂或標(biāo)準(zhǔn)飲食中飼養(yǎng)20w，期間喂食或不喂食奧美沙坦8w，觀察奧美沙坦對(duì)NAFLD脂肪變和炎癥的影響。結(jié)果表明奧美沙坦藥物能明顯減輕肝臟脂肪變的程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥相關(guān)通路活化。炎性因子TNF－α和IL－6 mRNA的表達(dá)明顯減低，而與其相關(guān)的NF－κB通路活化也被抑制。表明奧美沙坦能夠減輕NAFLD肝臟炎性改變，從而可能減緩NASH的發(fā)生發(fā)展。

RAS的活性被認(rèn)為與NASH的病理進(jìn)展密切相關(guān)。肝臟的RAS通路可能成為NASH治療的靶向通路。AngⅡ缺乏的小鼠不易由高脂飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生脂肪肝，而過量AngⅡ注射能誘導(dǎo)正常小鼠出現(xiàn)脂肪肝，且呈劑量依賴性［13］，說明AngⅡ在NASH發(fā)生的“第一次打擊”脂肪變中起著不可或缺的作用。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論相一致，奧美沙坦治療的小鼠肝功能（ALT，AST）得到明顯改善，且血清TG水平和肝細(xì)胞脂肪變明顯減輕。

實(shí)驗(yàn)表明，奧美沙坦治療的NAFLD小鼠中，肝臟中TNF－α和IL－6mRNA表達(dá)均降低，而目前認(rèn)為TNF－α和IL－6與全身性和肝臟局部胰島素抵抗、肝細(xì)胞損傷和凋亡、白細(xì)胞趨化，以及肝星狀細(xì)胞激活密切相關(guān)［14］，而AT1a受體敲除的小鼠肝臟炎癥改變減輕［15］。研究表明 NAFLD的患者與正常人相比其TNF－α以及IL－6的血漿表達(dá)明顯增加，其表達(dá)上升的程度與肝臟纖維化的程度呈正相關(guān)［16］。因此降低 TNF－α和IL－6的表達(dá)在 NASH中起到了重要的作用。

TNF－α和IL－6炎癥表達(dá)進(jìn)展的重要的通路為NF－κB通路。NF－κB家族包括五個(gè)成員，RelA（P65），C－Rel，Rel B，NF－κB1（P50和它的前體P105）和NF－κB2（P52以及其前體P100）。所有NF－κB成員為二聚體，如異二聚體 RelA／P50，C－Rel／P52與 NF－κB介導(dǎo)的基因活性相關(guān)，而同二聚體P50和P52作用為轉(zhuǎn)錄抑制蛋白。在靜止的細(xì)胞中，IκB與至少一個(gè)NF－κB的聚合體相結(jié)合而抑制NF－κB在細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及與DNA的結(jié)合。NF－κB的經(jīng)典通路為TNF－α激活TNFR1，進(jìn)一步活化細(xì)胞內(nèi)的IKK復(fù)合體（包括催化亞基IKKα，IKKβ和調(diào)節(jié)性亞基 NEMO）。IKKβ介導(dǎo)IκBα的磷酸化。IκBα被認(rèn)為是調(diào)節(jié)NF－κB經(jīng)典途徑的主要IκB蛋白質(zhì)，IκB降解釋放轉(zhuǎn)錄因子 NF－κB，使其轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，與κB部位相結(jié)合，以及激活基因轉(zhuǎn)錄［17］。在本實(shí)驗(yàn)中，NF－κB和P－IκBα的蛋白表達(dá)在高脂飲食對(duì)照組明顯高于高脂飲食治療組，而IκBα的蛋白表達(dá)在高脂飲食對(duì)照組明顯低于高脂飲食治療組。說明在NAFLD，炎癥通路NF－κB被激活，而奧美沙坦治療的NASH小鼠中NF－κB的激活被抑制。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ARB類藥物奧美沙坦可以明顯的減輕NAFLD小鼠的脂肪變性和炎性改變，為抑制NASH的發(fā)生發(fā)展提供了可行性。RAS系統(tǒng)在NAFLD治療中有望成為一個(gè)較好的靶點(diǎn)。但由于NAFLD機(jī)制復(fù)雜，且RAS系統(tǒng)對(duì)全身均有作用，故ARB類藥物能否作為NAFLD治療藥物還需要進(jìn)一步的研究。

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