張殿寶，施 萍，龐希寧*

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究室;2.附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)教研室，遼寧沈陽(yáng)110001)

隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和DNA 元件百科全書計(jì)劃(encyclopedia of dna elements，ENCODE)等后基因組計(jì)劃的實(shí)施［1］，將大量的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為功能和臨床相關(guān)的信息成為我們新的挑戰(zhàn)。解決該問(wèn)題的核心是闡明基因型對(duì)表現(xiàn)型的影響［2］。傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)失活靶基因的效率低下、耗時(shí)費(fèi)力且具有回復(fù)突變的風(fēng)險(xiǎn)，RNAi 技術(shù)對(duì)靶基因失活不完全、重復(fù)性差、有脫靶效應(yīng)［3］，因此亟需優(yōu)秀的基因組編輯工具克服這些缺點(diǎn)。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的人工核酸酶(engineered nucleases，EN)技術(shù)為此帶來(lái)了新的曙光，使研究者能夠?qū)Σ煌锓N和細(xì)胞中的幾乎所有基因進(jìn)行編輯［4］。本文對(duì)EN 的類型、原理、應(yīng)用及存在的問(wèn)題等進(jìn)行綜述。

1 利用EN 進(jìn)行基因組定點(diǎn)修飾的一般原理

EN 進(jìn)行基因組定點(diǎn)修飾主要包括2 個(gè)步驟［5］:首先，設(shè)計(jì)并構(gòu)建EN，進(jìn)而在靶位切斷基因組DNA，形成雙鏈斷裂(double-strand break，DSB);其次，DNA 損傷激活DNA 修復(fù)通路，啟動(dòng)自我修復(fù)。修復(fù)通常由一種或兩種途徑完成:切斷的DNA 末端進(jìn)行易錯(cuò)的非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)，或利用DNA 模板進(jìn)行同源重組(homologous recombination，HR)。NHEJ 修復(fù)能夠產(chǎn)生較小的插入或缺失，使基因發(fā)生突變或完全敲除;而以引入的同源DNA 為模板進(jìn)行HR 修復(fù)，能夠?qū)蚪M進(jìn)行定點(diǎn)修飾。

2 人工核酸酶的類型

目前，EN 主要包括4 類:鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)、CRISPR/Cas 系統(tǒng)(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated systerm，CRISPR/Cas)和人工的大范圍核酸酶(engineered meganuclease，EM)。

2.1 ZFN

ZFN 由DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域組成。DNA 結(jié)合域來(lái)自鋅指蛋白(zinc-finger protein，ZFP)，一般包括3 ～6 個(gè)Cys2His2 鋅指重復(fù)單位，每個(gè)ZFP 能夠相對(duì)特異地識(shí)別靶位上的3 個(gè)連續(xù)的堿基，因此每對(duì)ZFN 能夠識(shí)別18 ～36 個(gè)堿基。ZFP 由約30 個(gè)氨基酸殘基組成，呈α-β-β 結(jié)構(gòu)，其中α 螺旋中的－1 ～+6 氨基酸殘基決定其特異性，改變這些氨基酸的組成可以設(shè)計(jì)出識(shí)別不同堿基的ZFP。ZFN 的切割結(jié)構(gòu)域與結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C 端相連，目前多應(yīng)用來(lái)源于海床黃桿菌(Flavobacterium okeanokoites)的Fok Ⅰ核酸酶，F(xiàn)ok Ⅰ能夠二聚化產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性［6］。

將ZFN 的質(zhì)?；騧RNA 通過(guò)轉(zhuǎn)染或注射進(jìn)入細(xì)胞后，核定位信號(hào)引導(dǎo)ZFN 進(jìn)入細(xì)胞系，兩個(gè)ZFN分子的Fok Ⅰ結(jié)合結(jié)構(gòu)域與目標(biāo)位點(diǎn)結(jié)合，如果DNA 雙鏈上的這兩個(gè)位點(diǎn)的方向和距離合適，兩個(gè)Fok Ⅰ分子在間隔區(qū)形成二聚體，造成DSB，啟動(dòng)DNA 修復(fù)機(jī)制［7］。

ZFN 的構(gòu)建包括靶位選擇、ZFP 構(gòu)建、Fok Ⅰ切割域的選擇和優(yōu)化等步驟。ZFN 的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，除了根據(jù)已知的ZFP 結(jié)合位點(diǎn)直接構(gòu)建ZFN 外，Joung 成立的“鋅指聯(lián)合會(huì)”提供在線軟件ZiFiT，其中包括模塊組裝(modular assembly，MA)，OPEN(oligomerized pool engineering)和CoDA(context dependent assembly)方法;另外，還有Sangamo 私有的雙鋅指模塊組裝方法和Wolfe 實(shí)驗(yàn)室的方法等可供選擇使用。

目前，ZFN 已應(yīng)用于植物、動(dòng)物和微生物的研究中。與傳統(tǒng)的基因操作技術(shù)相比，技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，尤其是定點(diǎn)整合的突破。一般情況下，引入細(xì)胞的ZFN 為瞬時(shí)表達(dá)，對(duì)細(xì)胞毒性較小。但是，ZFN 的設(shè)計(jì)篩選耗時(shí)費(fèi)力，而且可能存在脫靶效應(yīng)，使其未能成為廣泛應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)［8］。

2.2 TALEN

TALEN 自2010年成功應(yīng)用于基因打靶，結(jié)構(gòu)與ZFN 類似，其DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域TALE 蛋白家族來(lái)自黃單胞桿菌(Xanthomonas spp.)。該結(jié)構(gòu)域由12 ～30 個(gè)重復(fù)單元串聯(lián)構(gòu)成，每個(gè)重復(fù)單元由33 ～35 個(gè)氨基酸殘基組成，其中的第12、13 位氨基酸殘基稱為重復(fù)可變雙殘基(repeat variable di-residue，RVD)。每個(gè)RVD 負(fù)責(zé)識(shí)別1 個(gè)DNA 堿基，不同的RVD 能夠特異性識(shí)別4 種堿基中的一種或多種［9］。TALE 重復(fù)單元與靶序列具有很好的對(duì)應(yīng)性，編碼比ZFN 簡(jiǎn)單，對(duì)提高特異性和設(shè)計(jì)人工核酸酶更有利。將設(shè)計(jì)好的TALE 與Fok Ⅰ核酸酶融合，就形成了能夠識(shí)別并切割特定DNA 序列的新核酸酶TALEN。TALEN 蛋白一般在N 端有轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)(translocation signal)，C 端有核定位信號(hào)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)，中部是介導(dǎo)其與DNA 特異識(shí)別與結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。一對(duì)TALEN 分子與靶位結(jié)合后，F(xiàn)ok Ⅰ在間隔區(qū)二聚化切斷 DNA 雙鏈，形成DSB［10］。

靶位點(diǎn)的選擇和TALEN 的組裝是應(yīng)用TALEN的關(guān)鍵。目前普遍認(rèn)為，TALEN 靶位點(diǎn)5'端前一位的堿基應(yīng)為T。為優(yōu)化設(shè)計(jì)，一些實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)TALEN 靶點(diǎn)的服務(wù)器可供使用，如TALE-NT(https://tale-nt．cac．cornell．edu)、ZiFiT (http://zifit．partners．org/ZiFiT)和idTALE(http://idtale．kaust．edu．sa)等。

TALE 重復(fù)單元的序列幾乎相同，提高了串聯(lián)克隆的難度。TALEN 的構(gòu)建主要依靠分子克隆的手段，目前已形成了幾種快速有效的方法:基于Golden Gate 分子克隆的方法，根據(jù)單體的來(lái)源不同可分為基于PCR 的Golden Gate-PCR 和傳統(tǒng)的基于質(zhì)粒載體的Golden Gate-Vector;基于連續(xù)克隆組裝的方法:包括限制性酶切-連接法(restriction enzyme and ligation，REAL)、單元組裝法(unit assembly，UA)和id-TALE 一步酶切次序連接法;基于固相合成的高通量方法:包括FLASH 和ICA(iterative capped assembly);基于長(zhǎng)黏末端的LIC(ligation-independent cloning)組裝方法等。

目前，TALEN 已在體外及植物、酵母、動(dòng)物和人細(xì)胞中得到應(yīng)用。TALEN 有潛力成為一種操作方便、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)高效、適用范圍廣的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)。

2.3 CRISPR/Cas 系統(tǒng)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一種基于Ⅱ型原核CRISPR 自適應(yīng)免疫系統(tǒng)的基因組編輯工具，由RNA 引導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)DNA 進(jìn)行靶向編輯［11］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)存在于約40%的細(xì)菌和90%的古生菌中，用于抵抗外源的DNA 片段［12］?；撔枣溓蚓鶶treptococcus pyogenes 中的Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)組成比較簡(jiǎn)單，易于構(gòu)建和使用，其中包括Cas9 核酸酶和兩個(gè)非編碼RNA:一個(gè)成熟的CRISPR RNA(crRNA)和一個(gè)部分互補(bǔ)的反式作用RNA(tracrRNA)，這3 個(gè)組分能夠有效地沉默外源DNA［13］。目前，研究者已成功構(gòu)建小引導(dǎo)RNA(sgRNA)優(yōu)化CRISPR/Cas 系統(tǒng)。sgRNA 包含3 個(gè)結(jié)構(gòu)域:約20 nt 的互補(bǔ)區(qū)決定其與DNA 結(jié)合的特異性;約42 nt 的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域模擬tracrRNA-crRNA復(fù)合物，能夠與Cas9 結(jié)合;此外，還包括一個(gè)約40 nt的轉(zhuǎn)錄終止子。結(jié)合特異性由sgRNA-DNA 堿基配對(duì)和DNA 互補(bǔ)區(qū)上游的前間隔相鄰基序(protospacer adjacent motifs，PAM)決定［14］。CRISPR 系統(tǒng)只需要Cas9 蛋白和sgRNA 就能夠進(jìn)行宿主非依賴性的基因打靶，將表達(dá)Cas9 和sgRNA 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，Cas9 蛋白與sgRNA 結(jié)合形成蛋白-RNA 復(fù)合物，該復(fù)合物與DNA 靶位通過(guò)堿基配對(duì)特異性結(jié)合后，靶位DNA 在核酸內(nèi)切酶Cas9 的作用下形成DSB［15］。

使用CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)編輯不需要構(gòu)建大分子質(zhì)量的核酸酶，只需要設(shè)計(jì)引導(dǎo)RNA 就能對(duì)幾乎任意序列進(jìn)行靶向編輯。該系統(tǒng)已成功應(yīng)用于微生物、動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并可以同時(shí)作用于多個(gè)靶位［16］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)與ZFN 和TALEN 相比，具有更好的擴(kuò)展性，更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、易于構(gòu)建。

2.4 人工大范圍核酸內(nèi)切酶

大范圍核酸內(nèi)切酶廣泛存在于微生物中，能夠識(shí)別較長(zhǎng)的DNA 序列(＞12 bp)，具有較好的特異性。但是，目前已知的MN 較少，不能覆蓋所有的靶位點(diǎn)，不能夠作為切割特異性位點(diǎn)的工具。為此，研究者試圖人工構(gòu)建更多的MN 以供使用:使用突變的方法構(gòu)建識(shí)別特異序列的MN［17－18］;有研究者將不同的酶融合在一起形成雜交酶，識(shí)別新的序列［19］;另外，“rationally designed meganuclease”方法(US Patent No:8338157、8304222)是改變與DNA 相互作用的氨基酸來(lái)設(shè)計(jì)特異性位點(diǎn)的MN。最近，有研究人員成功應(yīng)用MN 構(gòu)建了基因敲除小鼠和大鼠［20］。MN 與靶位的識(shí)別比較嚴(yán)格，因此其毒性可能小于以上幾種人工核酸酶。由于MN 種類的限制，目前還不能大范圍應(yīng)用于基因組定點(diǎn)修飾。

3 展望

ZFN、TALEN 和CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為基因組定點(diǎn)修飾工具的應(yīng)用具有革命性意義。長(zhǎng)期以來(lái)，ZFP是唯一能夠提供與DNA 定點(diǎn)結(jié)合的蛋白和酶的技術(shù)，但方法本身的復(fù)雜性限制了它的應(yīng)用。直到TALE 與DNA 特異性識(shí)別的分子密碼被破解后，研究人員借鑒ZFN 的策略對(duì)天然的TALE 進(jìn)行改造，使其成為基因組定點(diǎn)編輯的工具，由于其技術(shù)門檻較低，一出現(xiàn)就得到了廣泛的研究和應(yīng)用。而最近發(fā)展起來(lái)的CRISPR/Cas 系統(tǒng)似乎可以更簡(jiǎn)便地進(jìn)行基因組編輯。雖然這些基因組編輯工具的效率、毒性等還需要進(jìn)一步評(píng)估，但隨著研究的深入，人工核酸酶技術(shù)的進(jìn)步必然推動(dòng)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和個(gè)體化治療的發(fā)展。

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