羅海波 ， 陳 偉 ， 周靜峰 ， 宋慧波 ， 郁志芳

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 生物與食品系，浙江 寧波 315100；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京210095；浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，直接參與生命的各種生理代謝活動，是生物細(xì)胞各種代謝和調(diào)控途徑的靶分子，也是聯(lián)系基因和生理代謝的重要橋梁[1]。隨著功能基因組學(xué)的興起，蛋白質(zhì)組學(xué)成為生命科學(xué)研究的重要內(nèi)容，目前已廣泛應(yīng)用于植物生理的研究，如植物群體遺傳蛋白質(zhì)組、植物信號應(yīng)答蛋白質(zhì)組和植物組織器官蛋白質(zhì)組等[2]。雙向電泳技術(shù)（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）作為蛋白質(zhì)組學(xué)三大關(guān)鍵核心技術(shù)之一，是目前惟一能同時將上千種蛋白質(zhì)分離和展示的方法，也是分析復(fù)雜組分蛋白質(zhì)分辨率最高的工具[3]。由于植物中蛋白質(zhì)含量相對較低，且含有如色素、淀粉、多糖、多酚、單寧和有機(jī)酸類等大量干擾性物質(zhì)，給植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究增加了困難，因而雙向電泳技術(shù)在植物中的應(yīng)用早期主要集中于擬南芥[4]、水稻[5]、小麥[6]、玉米[7]等傳統(tǒng)模式作物。近年來，隨著蛋白質(zhì)提取技術(shù)的改進(jìn)，雙向電泳技術(shù)在桃[8]、草莓[9]、柑橘[10]、西紅柿[11]、生菜[12]、發(fā)菜[13]等水果蔬菜中的應(yīng)用逐漸增多，但在茭白中的應(yīng)用鮮見報道。茭白屬禾本科宿根性多年水生草本植物，是我國特有的水生蔬菜，其質(zhì)地脆嫩、味道鮮美且營養(yǎng)豐富，素有“水中參”的美稱[14]。然而，茭白不耐貯藏，采后常溫下3 d左右就出現(xiàn)組織軟化及木纖化等品質(zhì)劣變現(xiàn)象，商品價值急劇下降。研究茭白采后品質(zhì)劣變過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)，對從分子層面深入揭示茭白品質(zhì)劣變機(jī)制具有重要意義。作者以茭白為研究對象，擬通過對總蛋白質(zhì)提取方法和雙向電泳條件的優(yōu)化，建立適合分離茭白蛋白質(zhì)的雙向電泳技術(shù)體系，為進(jìn)一步開展茭白差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 試驗(yàn)用茭白為5月上旬成熟的江蘇地產(chǎn)露天茭白，采收后剝?nèi)ネ鈿と~鞘，迅速用液氮冷凍，保存于-70℃冰箱備用。

1.1.2 試劑 苯甲基磺酰氟（PMSF）、乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）、固化pH梯度干膠條（IPG，）、兩性電解質(zhì)（Bio-Lyte）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、丙烯酰胺（Arc）、N，N′-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、二甲氨基丙磺酸（CHAPS）、低熔點(diǎn)瓊脂糖、考馬斯亮藍(lán)G-250:購自美國Bio-Rad公司；三氯乙酸（TCA）、尿素、硫脲、甘氨酸、β-巰基乙醇（β-Me）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、過硫酸銨、礦物油、Tris平衡酚、四甲基乙二胺（TEMED）、牛血清蛋白（BSA）:均為分析純。

1.1.3 儀器 高速冷凍離心機(jī):GL-20G-Ⅱ，上海安亭科學(xué)儀器廠；微量高速冷凍離心機(jī):美國FRESCO 17 Thermo電子公司；等電聚焦儀:Protean IEF System，美國Bio-Rad公司；大型垂直電泳槽:PROTEAN II XL Cell，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng):Versdoc 3000，美國Bio-Rad公司。

1.2 蛋白質(zhì)提取與含量測定

1.2.1 三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法 參照劉倩等[15]的方法稍作修改。稱取5.0 g茭白樣品，用液氮研磨成粉，加入一定量的提取液Ⅰ （含10%TCA和0.07%DTT的丙酮溶液），-20℃沉淀過夜；4℃、13 000 g離心15 min，棄上清液；加入提取液Ⅱ （含0.07%DTT的丙酮溶液）于-20℃沉淀1 h，4℃、16 000 g離心15 min，棄上清液，重復(fù)用提取液Ⅱ懸浮沉淀3次。沉淀放入4℃冰箱中干燥后溶于1 mL水化液 （7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4%CHAPS，1%DTT，0.5%Bio-Lyte）中，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 改良酚抽法 參照Zhang等[8]的方法稍作修改。稱取5.0 g茭白樣品，用液氮研磨成粉，加入50 μL、100 mmol/L PMSF原液和 5～6 mL 4℃預(yù)冷 2 h以上的蛋白質(zhì)提取液 （含有 60 mmol/L Tris，1.05 mol/L 蔗糖，10 mmol/L EGTA，1%Triton X-100以及1mmol/LDTT，pH8.3）繼續(xù)研磨。勻漿液以16 000 g離心30 min。上清液中加入2.5～3倍體積的pH為7.8的Tris-飽和酚，充分搖蕩，混勻，4℃靜置1～2 h，16 000 g、4 ℃離心 30 min，取上層酚相，加入至少5倍體積-20℃預(yù)冷丙酮，充分混勻，-20℃下過夜培養(yǎng)，沉淀蛋白質(zhì)。沉淀分別用預(yù)冷的甲醇和丙酮沖洗2次，4℃下干燥后溶于1 mL水化液中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白質(zhì)的測定 參照Bradford[16]的方法進(jìn)行。

1.3 雙向電泳

第一向采用17 cm pH 3-10或pH 4-7的biorad預(yù)制膠條進(jìn)行水化上樣 （上樣量分別為0.8、1.0 mg，上樣體積350 μL），參照表1設(shè)置等電聚焦程序。等電聚焦結(jié)束后將第一向膠條分別置于含2%DTT和 2.5%IAA的平衡液中 （6 mol/L尿素，75 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，20%甘油，4 g/dL SDS）各平衡15 min，然后再轉(zhuǎn)移第二向垂直電泳。

表1 17 cm線性膠條的雙向電泳等電聚焦程序Table 1 Isoelectric focusing programme of 2-DE with 17 cm liner strips

第二向SDS-PAGE采用的膠質(zhì)量濃度為12 g/dL，采用恒功率進(jìn)行垂直電泳，起始用1 W/gel進(jìn)行100 min后，改為15 W/gel直到溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部，停止電泳，取下凝膠。

染色方法采用考馬斯亮藍(lán)G-250膠體考染。凝膠在（40%甲醇，10%冰醋酸，50%超純水）中固定2 h，用改進(jìn)的膠體考染液（0.12%G-250，10%磷酸，10%硫酸銨，20%甲醇）染色過夜，用蒸餾水沖洗凝膠兩次，加入脫色液（10%甲醇，8%冰醋酸，82%超純水）進(jìn)行脫色，直到凝膠背景清晰，蛋白質(zhì)點(diǎn)明顯可見為止。

1.4 凝膠的圖像采集與分析

脫色后的凝膠用Versdoc 3000凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分辨率為300 dpi，保存為GSC的圖像文件，應(yīng)用PDQuest 7.2軟件進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對蛋白質(zhì)產(chǎn)量和2-DE效果的影響

試驗(yàn)用TCA/丙酮沉淀法和改良酚抽法提取茭白總蛋白質(zhì)，經(jīng)Bradford法定量分析表明，用TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度平均值為4.95 mg/mL，而改良酚抽法為19.98 mg/mL，約為TCA/丙酮沉淀法的4倍，差異顯著，表明改良酚抽法對茭白總蛋白質(zhì)提取效果明顯優(yōu)于TCA/丙酮沉淀法。取TCA/丙酮沉淀法和改良酚抽法得到的蛋白質(zhì)樣品，分別以17 cm、pH 3～10 和 pH 4～7 IPG 膠條、1.0 mg上樣量、12 g/dL SDS-PAGE進(jìn)行雙向電泳分離，0.12%考馬斯亮藍(lán)G-250膠體考染法染色，比較兩種提取方法對2-DE效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖l顯示，用TCA/丙酮沉淀法和改良酚抽法提取的蛋白質(zhì)，所得的2-DE圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)均較清晰呈圓形，凝膠背景干凈，分辨率較高，橫豎條紋干擾較少。經(jīng)PDQuest 7.2軟件統(tǒng)計(jì)分析，在相同參數(shù)設(shè)置條件下，TCA/丙酮沉淀法在膠面上可分辨出93個蛋白質(zhì)點(diǎn)，改良酚抽法則可檢測到657個清晰的蛋白質(zhì)點(diǎn)，比TCA/丙酮沉淀法多564個蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)一步證明了改良酚抽法對茭白總蛋白質(zhì)提取效果優(yōu)于TCA/丙酮沉淀法。然而，劉倩等[15]采用TCA/丙酮沉淀法提取茭白總蛋白質(zhì)，銀染法染色后所得的2-DE圖譜可檢測到1 500個蛋白質(zhì)點(diǎn)，這可能與銀染法的高靈敏度有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

圖1 不同提取方法對茭白2-DE圖譜的影響Fig.1 Effect of different protein extraction methods on 2-DE map of Z.latifolia

2.2 第一向等電聚焦pH范圍對2-DE效果的影響

為獲得最適合茭白總蛋白質(zhì)分離的IPG膠條pH范圍，首先采用17 cm、pH 3～10的IPG膠條對TCA/丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳分析，結(jié)果見圖1a。圖1a顯示，茭白總蛋白質(zhì)主要分布在酸性至中性區(qū)域，而堿性端蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量較少，且蛋白質(zhì)點(diǎn)存在一些重疊現(xiàn)象，表明利用pH 3～10的膠條不能有效地將蛋白質(zhì)點(diǎn)分開。為了達(dá)到更好的分離效果，用pH 4～7的膠條對改良酚抽法提取的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，分離效果明顯提高，在pH 3～10膠條上沒有分開的點(diǎn)已經(jīng)完全分開，沒有明顯的重疊現(xiàn)象，在整個圖譜上的分布較為理想，極大地提高了2-DE圖譜的分辨率（圖1b）。

2.3 蛋白質(zhì)上樣量和SDS-PAGE膠質(zhì)量濃度對2-DE效果的影響

取酚抽法得到的茭白蛋白質(zhì)樣品，選用17 cm、pH 4～7的IPG膠條，分別取0.8、1.0 mg的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行雙向電泳。上樣量為0.8 mg時，2-DE圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)較少，只檢測到596個蛋白質(zhì)點(diǎn)，蛋白質(zhì)點(diǎn)豐度均較弱，尤其低豐度蛋白質(zhì)不能被檢測到，影響了雙向電泳的準(zhǔn)確性和重復(fù)性（圖2a）；上樣量為1.0 mg時，蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)較多，檢測到657個蛋白質(zhì)點(diǎn)，且蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，重疊現(xiàn)象少，圖譜質(zhì)量較佳（圖 2b）。

此外，SDS-PAGE分離膠濃度也是影響蛋白質(zhì)分離效果的重要因素。雙向電泳中，由于不同來源的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量范圍不同，適宜的SDS-PAGE凝膠質(zhì)量濃度亦不同。根據(jù)多次試驗(yàn)分析表明，茭白總蛋白質(zhì)第二向SDS-PAGE膠的質(zhì)量濃度在12 g/dL最為合適，太低會導(dǎo)致小相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)點(diǎn)丟失，太高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)點(diǎn)分辨率不高，且出現(xiàn)部分蛋白質(zhì)點(diǎn)重疊現(xiàn)象。于馮等[17]在對秋茄葉片及劉麗娟等在對生菜葉片總蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的研究中也得到類似結(jié)果。

圖2 不同蛋白質(zhì)上樣量對茭白雙向電泳圖譜的影響Fig.2 Effect of different loading quantities on 2-DE maps of Z.latifolia

3 討論

3.1 蛋白質(zhì)提取方法

蛋白質(zhì)樣品制備是雙向電泳技術(shù)體系中最關(guān)鍵的步驟，樣品中蛋白質(zhì)的種類、純度和再溶性將直接影響雙向電泳的成敗。丙酮法、TCA/丙酮法和酚抽法是目前植物組織蛋白質(zhì)提取常用的3種方法。然而，由于不同植物其組成成分各不相同，而且含有大量干擾性物質(zhì)如色素、多糖、核酸、脂類和鹽類等，至今并沒有哪一種方法能適用于所有植物，研究人員往往根據(jù)自己研究的實(shí)驗(yàn)材料探索適宜的蛋白質(zhì)提取方法。Muccilli等[10]比較了TCA/丙酮法和酚抽法提取柑橘果實(shí)總蛋白的效果，發(fā)現(xiàn)酚抽法提取得到的蛋白質(zhì)純度高，經(jīng)雙向電泳分析能得到分辨率較高的圖譜；梁文裕等[13]對發(fā)菜總蛋白質(zhì)提取方法的研究表明，改良TCA/丙酮法得到的蛋白質(zhì)含量雖然少于酚抽法，但電泳圖譜顯示蛋白質(zhì)分離效果較酚抽法好，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰。作者比較了TCA/丙酮法和酚抽法提取茭白總蛋白的雙向電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)利用酚抽法提取蛋白質(zhì)，不僅提取效率高，而且雜質(zhì)干擾少，得到的2-DE圖譜中，蛋白質(zhì)條帶清晰，數(shù)量較多，適合茭白總蛋白質(zhì)的提取。

3.2 上樣量的選擇

上樣量的多少是影響2-DE圖譜清晰度及蛋白質(zhì)點(diǎn)多少的另一重要因素，受到IPG膠條長度、pH范圍、染色方法、高豐度和低豐度蛋白的分布等多種因素的制約。過低的上樣量不利于一些低豐度蛋白的檢測，但過高的上樣量也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)在聚焦過程中發(fā)生沉積而不能很好地進(jìn)入IPG膠條。甘露等對甘藍(lán)型油菜蛋白質(zhì)雙向電泳體系研究表明，采用17 cm、pH 4～7的IPG膠條時，最適蛋白質(zhì)上樣量為1.0 mg。本試驗(yàn)選用17 cm、pH 4～7的IPG膠條、考馬斯亮藍(lán)G-250染色，比較了0.8、1.0 mg兩種不同上樣量的雙向電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)上樣量為1.0 mg時，得到電泳圖譜中蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)較多、背景清晰。

3.3 IPG膠條pH范圍

IPG膠條pH范圍對雙向電泳圖譜也有重要影響。寬pH范圍的IPG膠條能初步分析蛋白質(zhì)的分布狀況，但是等電點(diǎn)相近的蛋白質(zhì)難以有效分離，窄pH范圍IPG膠條盡管會丟失其pH值范圍之外的蛋白質(zhì)，但分辨率和靈敏度大大提高。作者首先采用pH 3～l0的IPG膠條對茭白蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)茭白蛋白質(zhì)主要分布在pH 4～7范圍，進(jìn)一步選用pH 4～7范圍的IPG膠條進(jìn)行雙向電泳分離，分辨率得到顯著提高。

4 結(jié)語

通過對茭白總蛋白不同提取方法、不同pH梯度范圍、不同蛋白質(zhì)上樣量的選擇，探索出一套適合茭白蛋白質(zhì)分析的雙向電泳方法，即采用改良酚抽法制備蛋白質(zhì)干粉、17 cm、pH 4～7的膠條、1.0 mg的蛋白質(zhì)上樣量、12 g/dL的SDS-PAGE凝膠濃度，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250膠體考染法染色后可獲得分辨率高、重復(fù)性好的蛋白質(zhì)2-DE圖譜。

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