苗迎秋，王賀新，李根柱，張自川，湯 莉

（1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.大連大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院，遼寧 大連 116622）

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum Linn.）為杜鵑花科越橘屬植物，落葉灌木，果實(shí)為藍(lán)紫色小漿果，含有較高的花青素類（Anthocyanins）物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗氧化活性和較高的保健價(jià)值[1-2]。在我國(guó)篤斯越橘主要分布在大興安嶺北部及小興安嶺和長(zhǎng)白山地區(qū)。在長(zhǎng)白山地區(qū)，野生篤斯越橘主要生長(zhǎng)在海拔700～2 000 m之間的針闊混交林、林溝濕草地、沼澤等地帶，呈塊狀或片狀分布[3]。

菌根是植物根系和真菌所建立的共同體，是植物與微生物所形成的互惠共同體，幾乎普遍存在于所有植物中[4]。一般認(rèn)為，越橘屬植物主要由歐石楠菌根真菌（Ericoid mycorrhiza，ERM）侵染，有時(shí)也有叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza，AM）和暗隔內(nèi)生菌根真菌（Dark septate endophytes，DSE）侵染[4-5]。但是，目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道僅涉及對(duì)篤斯越橘的資源調(diào)查、果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、樹(shù)木生理和開(kāi)發(fā)利用等方面，而有關(guān)其菌根方面研究鮮有報(bào)道。本研究組針對(duì)長(zhǎng)白山地區(qū)篤斯越橘菌根的形態(tài)結(jié)構(gòu)和菌根真菌的分布特征進(jìn)行初步觀察，為篤斯越橘菌根生態(tài)學(xué)研究及資源合理開(kāi)發(fā)和管理提供理論依據(jù)。

1 研究地點(diǎn)與方法

1.1 取樣地點(diǎn)概況

研究地點(diǎn)為長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū)東坡和長(zhǎng)白山麓的吉林哈泥省級(jí)自然保護(hù)區(qū)。長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū)海拔1 300 m以下的篤斯越橘部分生長(zhǎng)在泥炭蘚沼澤草甸子里，部分生長(zhǎng)在苔蘚層較厚的落葉松林下。調(diào)查樣地中心點(diǎn)位于42°02′37″N，128°21′36″E，距圓池入口西側(cè)約10 km、邊防公路北約2 km處。群落組成為8落2樺，林分為異齡復(fù)層林，篤斯越橘主要著生于透光度較好的林下或林間空地，呈團(tuán)狀或片狀分布，郁閉度＞6.0以上的林內(nèi)很少見(jiàn)到團(tuán)片狀的篤斯越橘灌叢，偶遇少量篤斯越橘卻株型細(xì)弱，生長(zhǎng)不良。土壤垂直結(jié)構(gòu)自上而下依次明顯分為4層，最上面第1層為活苔蘚層，相當(dāng)于凋落物層（O層）的L層，其中混有大量新鮮的落葉松凋落物，分解較少；第2層是死苔蘚層，相當(dāng)于凋落物層（O層）的F層，多為半分解的死苔蘚和落葉松凋落物；第3層主要由呈泥炭化的腐殖質(zhì)層（A1層）及其下部少量較薄的淀積層（A2層）組成，此處合并稱為泥炭層（A層），與下層過(guò)渡明顯；第4層為火山灰層（C層），由黃白色至棕黃色的火山灰及其顆粒組成。本項(xiàng)目的另一取樣地點(diǎn)為吉林哈泥省級(jí)自然保護(hù)區(qū)，位于吉林省長(zhǎng)白山西側(cè)的龍崗山脈中部。該區(qū)海拔557～1 212 m，屬溫帶濕潤(rùn)、半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候。調(diào)查樣地中心點(diǎn)位于42°13′27″N，126°29′35″E。兩處采樣地點(diǎn)均為篤斯越橘-落葉松林型，喬木多為長(zhǎng)白落葉松（Larix olgensis Henry），伴有白樺（Betula platyphylla）等闊葉樹(shù)，下層大灌木有柴樺（Betula fruticosa Pall），小灌木主要有細(xì)葉杜香（Ledum palustre L.）、越橘（Vaccinium vitis-idaea L.）、藍(lán)靛果忍冬（Lonicera edulis Turcz.）和山刺玫（Rosa davurica Pall）等。草本植物大部分是苔草（Carex spp.）和小葉章（Calamagrostis angustifolia Kom.Fern）等。各取樣點(diǎn)的篤斯越橘根系主要生長(zhǎng)在枯死苔蘚層和疏松的枯枝落葉層內(nèi)。

1.2 方法

2010年7月于上述區(qū)域隨機(jī)對(duì)篤斯越橘根部進(jìn)行取樣，取樣時(shí)輕輕去掉根系表面附著的苔蘚枯死殘留物，確保根尖完整，然后取根段在流水下輕輕沖洗干凈，選取不同粗細(xì)的營(yíng)養(yǎng)根，切成1 cm長(zhǎng)小段，用軟化酸處理后固定于FAA固定液中。用下列兩種方法進(jìn)行觀察。一是石蠟切片法，即將樣根帶回實(shí)驗(yàn)室后經(jīng)脫水、透明、采用常規(guī)石蠟切片法包埋、切片，并用番紅固綠對(duì)染和加拿大樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。二是對(duì)于纖細(xì)的毛根采用壓片方法直接觀察，即將FAA固定的根段經(jīng)20%KOH透明處理、再經(jīng)2%HCl酸化處理后，用0.02%棉藍(lán)染液染色，直接壓片后用光學(xué)顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 篤斯越橘根形態(tài)結(jié)構(gòu)

調(diào)查顯示，篤斯越橘的根系實(shí)際上是由根和根態(tài)莖共同組成，而根系的骨干部分還是以莖為主，莖代行骨干根的功能。真正的根并不發(fā)達(dá)，絕大部分為須根，稀疏地著生在根態(tài)莖上，有少量發(fā)生粗大一些的根，呈不規(guī)則的小彎曲狀，與既有研究一致[5]。成熟毛根非常纖細(xì)（直徑為150 μm以下），次生結(jié)構(gòu)不夠典型。一般周皮由3～4層木栓細(xì)胞組成，其中最外一層呈凋落狀；維管形成層、次生韌皮部和次生木質(zhì)部均不明顯，各占1～2層細(xì)胞；初生木質(zhì)部占有中心很小部分空間（見(jiàn)圖1A）；表面沒(méi)有根毛，包裹著1層或疏松或緊密的菌絲層（見(jiàn)圖1B）。直徑為200 μm以上的篤斯越橘根毛根的次生結(jié)構(gòu)較為明顯，周皮細(xì)胞5～6層，排列緊密，胞間隙小，壁木質(zhì)化，最外圍1～2層呈凋落狀，經(jīng)番紅固綠染色后呈紅色；維管形成層和次生韌皮部不明顯，各占1～2層細(xì)胞，而次生木質(zhì)部占有大部分空間（見(jiàn)圖1C）。切片結(jié)果還顯示篤斯越橘初生構(gòu)造中側(cè)根由中柱鞘細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)著木質(zhì)部放射角的細(xì)胞分生能力強(qiáng)，發(fā)生分裂，向外突起，形成側(cè)根。在側(cè)根形成過(guò)程中，分化出維管組織，并且與主根維管組織連接在一起（見(jiàn)圖1D）。

圖1 篤斯越橘菌根顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1 Microscopic morphology structure of mycorrhiza of Vaccinium uliginosum

2.2 篤斯越橘內(nèi)生菌根真菌的分布

從篤斯越橘根的連續(xù)石蠟切片中可以看到，在已經(jīng)開(kāi)始次生生長(zhǎng)的毛根內(nèi)，內(nèi)生菌根真菌主要侵染根的表皮細(xì)胞和周皮細(xì)胞（見(jiàn)圖2A、B），含有菌絲體的細(xì)胞壁有150 μm加厚跡象，形成典型的ERM菌絲圈。還發(fā)現(xiàn)在初生構(gòu)造的毛根內(nèi)，有菌根可以侵染到中柱情況，但沒(méi)有改變根的基本解剖結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖2C、D）。

圖2 篤斯越橘內(nèi)生菌根真菌的分布Fig.2 Distribution of endotrophicmycorrhiza fungi of Vaccinium uliginosum

2.3 篤斯越橘內(nèi)生菌根真菌的菌絲形態(tài)

棉藍(lán)染色壓片光鏡觀察結(jié)果顯示，根據(jù)菌絲及菌絲圈的形態(tài)判斷，至少有三種內(nèi)生真菌侵染篤斯越橘根部細(xì)胞。

一種是具有明顯的橫隔膜真菌菌絲能穿破篤斯越橘根表層細(xì)胞壁，并在其中定殖，不斷繁殖，并侵染皮層或周皮的下一層細(xì)胞，形成復(fù)雜濃密的菌絲群，即典型的歐石楠類菌絲復(fù)合體（見(jiàn)圖3A），構(gòu)成篤斯越橘的菌根菌的主體；

另一種是由具有明顯的橫隔膜、呈棕褐色且較粗的真菌菌絲形成的較疏松的暗隔內(nèi)生菌菌絲復(fù)合體（見(jiàn)圖3B），在調(diào)查的篤斯越橘根系中普遍存在；

第三種菌絲是沒(méi)有明顯的橫隔膜，但具有典型的二分叉結(jié)構(gòu)，并在細(xì)胞內(nèi)形成泡囊（見(jiàn)圖3C）和叢枝（見(jiàn)圖3D）的泡囊-叢枝菌絲復(fù)合體，在調(diào)查根系中數(shù)量不多但也經(jīng)常出現(xiàn)。

圖3 菌根細(xì)胞內(nèi)菌絲復(fù)合體形態(tài)Fig.3 Morphology of mycelium complex in mycorrhiza cell

3 討論與結(jié)論

3.1 篤斯越橘根的分布及菌根形態(tài)特征

篤斯越橘是東北森林群落的重要組成成分之一，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，相關(guān)研究很少。研究組在長(zhǎng)白山實(shí)地觀察結(jié)果顯示，篤斯越橘根系由根狀莖、行莖及其上面著生的細(xì)根和須根構(gòu)成，與分布于北美的同屬矮叢越橘（Vaccinium angustifolium Aiton）相似[6]，但是須根數(shù)量不多，明顯少于矮叢越橘。篤斯越橘根狀莖和須根只生長(zhǎng)在有苔蘚枯死體和落葉松等凋落物形成的松軟基質(zhì)內(nèi)，幾乎沒(méi)有礦質(zhì)土壤成分[7]。須根在分枝前直徑為50～80 μm，沒(méi)有根毛。研究指出菌根對(duì)杜鵑花類植物的營(yíng)養(yǎng)吸收以及增強(qiáng)對(duì)逆境因子的抗性等方面具有重要作用[8]，篤斯越橘的菌根是否在某種程度上起到根毛的作用有待于深入研究。

篤斯越橘根的形態(tài)特征表明，在次生構(gòu)造中具有明顯的周皮和次生木質(zhì)部，周皮細(xì)胞呈木栓化，胞內(nèi)空隙較大。維管形成層和次生韌皮部均不明顯，這可能是由于篤斯越橘的毛根過(guò)于纖細(xì)，不可能形成太多的細(xì)胞層次有關(guān)（見(jiàn)圖1）。另外，根系橫剖面圖顯示根表皮細(xì)胞脫落、變空，應(yīng)該是根系次生生長(zhǎng)產(chǎn)生的木栓保護(hù)層及其凋亡外層細(xì)胞。鏡下可見(jiàn)篤斯越橘的根周皮細(xì)胞壁呈現(xiàn)木質(zhì)化加厚，番紅固綠雙重染色后呈紅色，此厚壁細(xì)胞的形成一般被認(rèn)為是植物體的一種防御反應(yīng)，而且切片結(jié)果顯示直徑為50 μm以下的毛根表皮細(xì)胞壁也有呈現(xiàn)木質(zhì)化加厚，有可能是為了適應(yīng)長(zhǎng)白山特殊的土壤環(huán)境而形成的一種形態(tài)變化。

越橘屬植物的菌根主要由ERM菌根菌構(gòu)成[4-5,8]，通常在表皮細(xì)胞內(nèi)具有典型的ERM菌絲圈[9]。從圖1B可以看出，在毛根的表面具有一層疏松的菌絲層，這與大多數(shù)杜鵑科植物相同，從圖2A、B，圖3A可以看出，經(jīng)番紅固綠雙重染色后，細(xì)胞內(nèi)含有明顯深色團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)的就是受到菌絲侵染的細(xì)胞，整個(gè)皮層細(xì)胞層受到侵染的細(xì)胞隨機(jī)分布，一些根系已經(jīng)在表皮和周皮內(nèi)初步呈現(xiàn)環(huán)狀菌絲圈的特征。一般認(rèn)為，表層細(xì)胞是真菌與植物體相互作用的活躍部位，當(dāng)菌絲侵染到距內(nèi)皮層1～2層細(xì)胞時(shí)便停止侵染，也就是說(shuō)菌絲一般不能侵染內(nèi)皮層及中柱，從而使根仍能保持生活力。但本研究采集的菌根中表皮細(xì)胞、皮層細(xì)胞和中柱都有不同程度內(nèi)生真菌的侵染（見(jiàn)圖2B、C），但沒(méi)有改變根的基本解剖結(jié)構(gòu)，這在其他杜鵑花科植物中未見(jiàn)報(bào)道。這種現(xiàn)象是偶然的還是普遍存在的現(xiàn)象，對(duì)篤斯越橘有無(wú)影響等，有待于我們今后詳細(xì)研究確認(rèn)。

3.2 篤斯越橘菌根菌的種類

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)白山野生篤斯越橘菌根菌以歐石楠類菌根菌ERM為主，也有暗隔內(nèi)生菌根真菌DSE和泡囊-叢枝菌根真菌AM感染的現(xiàn)象（見(jiàn)圖3）。有關(guān)杜鵑花科植物菌根研究偏注重于ERM菌根菌，有報(bào)道在興安杜鵑菌根形態(tài)特征中發(fā)現(xiàn)除ERM外有少量AM侵染特征[10]，也有利用暗隔內(nèi)生菌根真菌（DSE）接種越橘類植物促進(jìn)其生長(zhǎng)報(bào)道[11]。說(shuō)明3種菌根菌在杜鵑花科及越橘屬植物根系內(nèi)存在。

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