楊芩　付燕　王永清　陶煉　鄧群仙　范建新　鄧仁菊

摘 要： 【目的】建立和優(yōu)化枇杷AS-PCR反應(yīng)體系，為開展枇杷S基因快速鑒定奠定基礎(chǔ)。【方法】以‘大五星、‘早鐘6號和‘龍泉5號為試材，通過正交實驗設(shè)計對影響枇杷AS-PCR反應(yīng)較大的Mg2+等5個因素的濃度進行篩選，并對擴增反應(yīng)程序進行優(yōu)化，運用正交設(shè)計直觀分析法和DPS 7.05統(tǒng)計軟件對擴增結(jié)果進行方差分析。【結(jié)果】優(yōu)化后的枇杷AS-PCR反應(yīng)分析體系為： 25 μL反應(yīng)體系中，含10×buffer2.5 μL，Mg2+濃度2.0 mmol·L-1，Taq酶1.5 U，引物0.5 μmol·L-1，模板DNA80ng，dNTPs0.4 mmol·L-1。反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；72℃延伸5 min，4 ℃保存?！窘Y(jié)論】建立了基于S基因保守序列設(shè)計引物的枇杷AS-PCR反應(yīng)體系，利用該體系成功確定了‘大五星的S基因型為S2-S41，其中S41為新分離鑒定的枇杷S-RNase基因，它們在GenBank 上的登錄號分別為JQ228451 和JX217035。

關(guān)鍵詞： 枇杷； AS-PCR； 正交設(shè)計； 反應(yīng)體系

中圖分類號：S667.3 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0062-07

配子體自交不親和性（GSI）在薔薇科果樹中普遍存在，是阻止自體受精，預(yù)防近親繁殖和保持遺傳變異的一種重要機制，這種特異的識別反應(yīng)在遺傳上受S位點復等位基因控制[1]。這主要表現(xiàn)為自花授粉或相同S基因型的品種異花授粉時，花粉管在花柱上部停止生長，造成自花授粉或相同S基因型品種間授粉不結(jié)實[2]。長期以來在實際生產(chǎn)中常依據(jù)品種間相互授粉的坐果率來選擇授粉樹，這種方法雖然直觀有效，但費時費力，同時由于不知道品種的S基因型，選擇時又具有較大的盲目性[3]。因此鑒定自交不親和的S基因型對生產(chǎn)栽培選擇授粉品種具有重要的指導意義。隨著分子生物學的快速發(fā)展，基于S基因保守序列設(shè)計引物的S基因特異PCR分析成為一種快速、簡便、可靠的S基因鑒定方法，并在蘋果、梨、甜櫻桃等果樹上得到了廣泛的應(yīng)用，但未見枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系系統(tǒng)優(yōu)化的研究報道。為此我們建立并優(yōu)化了枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系，為今后開展枇杷屬植物S基因鑒定，加強資源利用和指導生產(chǎn)選擇授粉品種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

以栽植于四川農(nóng)業(yè)大學園藝生物技術(shù)研究中心的‘大五星、‘早鐘6號和‘龍泉5號作為研究試材，采取未完全展開的幼嫩葉片提取基因組DNA。

1.2 基因組DNA提取

按照楊芩等[4]的方法提取基因組DNA，提取物用60 μL去離子水溶解，核酸蛋白儀（Eppendorf，BioPhotometer plus）測定DNA的濃度和純度，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，-20 ℃保存。

1.3 引物來源

采用Ishimizu等[5]根據(jù)梨S-RNase 基因C1 區(qū)和C5 區(qū)下游保守序列設(shè)計簡并引物： 上游引物： ‘FTQQYQ： 5'-TTTACGCAGCAATATCAG-3'，和下游引物： ‘FI （D/N）CP（H/R）： 5'-GYGGGGGCARTYTATGAA-3'，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 PCR擴增和優(yōu)化設(shè)計

采用L25（56）正交表，參照甜櫻桃[6]和蘋果[7]的AS-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系對影響反應(yīng)較大的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模板DNA濃度進行五因素五水平正交實驗設(shè)計，各因素水平見表1，以空白項為誤差項進行方差分析。

按表2編號加樣，除表中所列因素外，還包括2.5 μL10×buffer，加去離子水補足25 μL。以‘大五星DNA為模板對以上各因素進行優(yōu)化，反應(yīng)程序在參照甜櫻桃[6]、蘋果[7]AS-PCR反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上，初步確定為94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。

根據(jù)正交試驗結(jié)果，選擇合適的反應(yīng)體系，對引物的最佳退火溫度進行篩選。根據(jù)引物Tm值，設(shè)定退火溫度（48～62 ℃），PCR儀（Bio-Rad公司PTC-200）自動生成12個溫度梯度： 48 ℃、48.4 ℃、49.2℃、50.3 ℃、51.9 ℃、54 ℃、56.3 ℃、58.3 ℃、59.9 ℃、60.9 ℃、61.7 ℃、62.0 ℃。同時對循環(huán)次數(shù)、退火時間、延伸時間等影響AS-PCR反應(yīng)的重要因素進行優(yōu)化。

1.5 電泳結(jié)果評分及差異分析

參照何正文等[8]、付燕等[9]的正交設(shè)計直觀分析方法，對3次重復PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果分別評分。依擴增譜帶特異性與敏感性即譜帶多少、亮度的強弱和有無彌散現(xiàn)象評分，特異性譜帶越多、亮度越強、無彌散現(xiàn)象評分越高，反之評分越低。最好的處理定為25分，最差的處理定為1分，以這2個處理的結(jié)果為比較標準，再將其他處理的譜帶結(jié)果與這2個標準比較依次評分，評分結(jié)果用SNK法隨機區(qū)組模型（DPS 7.05統(tǒng)計軟件）進行方差分析。

1.6 S-RNase 基因克隆與序列分析

擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，Syngene 凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司），對PCR產(chǎn)物目的片段進行回收并連接到PGEM-Teasy （上海潤成生物科技有限公司） 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR鑒定，挑取陽性克隆測序（北京華大中生科技發(fā)展有限公司）。獲得序列分別利用國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的Blast和Nucleotide 軟件進行同源性序列檢索與序列登記。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計試驗結(jié)果的直觀分析評分及差異分析

按表2的5因素5水平正交設(shè)計25個處理進行PCR反應(yīng)后，將得到的產(chǎn)物進行電泳，其中1次重復電泳圖譜如圖1所示。不同Taq酶用量、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度和模板用量擴增的結(jié)果各不相同。各處理的直觀分析評分結(jié)果如表3所示。

采用DPS 7.05統(tǒng)計軟件運用SNK法隨機區(qū)組模型對各處理直觀分析評分進行方差分析，結(jié)果如表4所示。由F值可知，Mg2+對反應(yīng)影響最大，Taq酶影響最小，各因素水平變化對PCR反應(yīng)影響大小依次為： Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶。由于各因素水平間對AS-PCR擴增結(jié)果的影響差異顯著，進一步在因素內(nèi)進行多重比較。

2.2. 各因素對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響

2.2.1 Mg2+濃度對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 從表4中可以看出，PCR擴增結(jié)果受Mg2+濃度影響最大。從圖2可以看出，隨著Mg2+濃度增加，直觀評分結(jié)果均值總體呈先增加后下降的趨勢，當Mg2+濃度增加到2.0 mmol·L-1時，擴增結(jié)果均值最大，當Mg2+濃度增加到2.5 mmol·L-1時，擴增結(jié)果均值迅速下降。Mg2+各濃度間多重比較結(jié)果表明，25 μL體系中，各濃度間直觀評分結(jié)果差異極顯著。反應(yīng)液中的Mg2+濃度直接影響Taq酶活性，過低的Mg2+濃度使得Taq酶活性不能有效發(fā)揮，進而影響引物與模板的結(jié)合；而過高的Mg2+濃度又使得Mg2+與底物競爭Taq酶，抑制了酶的活性。因此，確定合適的Mg2+濃度對AS-PCR反應(yīng)至關(guān)重要。根據(jù)電泳圖譜與評分結(jié)果分析可知，適宜的Mg2+濃度為2.0 mmol·L-1。

2.2.2 Taq酶濃度對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 從方差分析可知Taq酶對AS-PCR反應(yīng)影響最?。ū?），這與圖3中Taq酶用量間的直觀評分結(jié)果變化幅度一致。Taq酶因素內(nèi)各水平多重比較結(jié)果表明，Taq酶用量為1.5 U時擴增結(jié)果顯著好于其他各用量，其他用量間差異不顯著，綜上認為在25 μL 反應(yīng)體系中1.5U Taq酶用量為枇杷AS-PCR反應(yīng)的適宜參數(shù)。

2.2.3 引物濃度對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 引物濃度對枇杷AS-PCR擴增產(chǎn)物有較大的影響（表4），引物多少關(guān)系到擴增產(chǎn)物的質(zhì)與量，濃度太低不能進行有效的擴增，濃度太高會增加錯配，增加非特異性擴增和引物二聚體的形成，導致擴增產(chǎn)物不是所需的特異性產(chǎn)物，或條帶不穩(wěn)定及清晰度下降。隨著引物濃度增加，擴增結(jié)果直觀評分均值逐漸增加，當引物濃度為0.5 μmol·L-1時，擴增結(jié)果均值最大，當引物濃度增加為0.6 μmol·L-1時，擴增結(jié)果均值迅速下降。引物因素內(nèi)各濃度間多重比較結(jié)果表明，濃度為0.5 μmol·L-1時擴增效果顯著好于其他濃度，因此選擇引物濃度為0.5 μmol·L-1為本實驗的反應(yīng)參數(shù)。

2.2.4 模板濃度對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 由方差分析可見，模板對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)影響較小，在40～80 ng內(nèi)擴增效果均較好（圖5）。DNA因素內(nèi)各用量多重比較結(jié)果表明，當模板DNA用量為80 ng或120 ng時擴增效果較好，并顯著好于其他用量處理，因此確定80 ng模板用量為本實驗的反應(yīng)參數(shù)。

2.2.5 dNTPs對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響 由方差分析可見，dNTPs的用量對枇杷AS-PCR反應(yīng)影響僅次于Mg2+。直觀評分結(jié)果均值顯示，在dNTPs濃度為0.40 mmol·L-1時就有較好的擴增結(jié)果，因素內(nèi)各濃度多重比較結(jié)果表明（圖6），dNTPs濃度為0.40 mmol·L-1時擴增結(jié)果顯著好于0.60 mmol·L-1、0.80 mmol·L-1、1.00 mmol·L-1 3個濃度處理，雖然當濃度增加至1.20 mmol·L-1時的擴增結(jié)果最好且顯著好于其他濃度處理，綜合考慮擴增效果和節(jié)約成本，選擇dNTPs濃度0.40 mmol·L-1為本實驗的反應(yīng)參數(shù)。

2.3 退火溫度對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響

AS-PCR引物序列一般由18～30個堿基組成，并且不同特異引物的GC含量差異較大，造成不同引物最佳退火溫度差異較大。圖7所示為退火溫度對本實驗所用引物組合的影響電泳圖譜。一般而言，退火溫度偏低，背景模糊，同時非特異帶擴增增加，給試驗結(jié)果分析帶來極大的困擾；退火溫度逐漸升高，可以減少不匹配的雜交，從而非特異性帶擴增逐漸減少，背景也逐漸清晰，擴增出的特異性帶整齊明亮，但如果退火溫度過高，擴增條帶少會使某一特異性條帶無法擴增，這也會對試驗結(jié)果分析造成較大的困擾，因此篩選不同引物組合的最適退火溫度對枇杷AS-PCR反應(yīng)至關(guān)重要。本實驗所用引物組合（圖7），當退火溫度低于54 ℃時，擴增條帶明顯增多，許多大分子質(zhì)量片段得到擴增，但背景較模糊，進一步的試驗分析與處理；當退火溫度高于54 ℃時，特異性條帶逐漸減少，最后不能擴增出特異性條帶。因此，綜合考慮擴增的完整性和清晰度，本實驗引物組合最佳退火溫度確定為54 ℃。

2.4 退火時間對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)的影響

實驗設(shè)置了25 s、30 s、40 s、50 s 4個退火時間對最佳退火時間進行篩選，結(jié)果表明退火時間為25 s時，擴增條帶有缺失，特異性帶擴增量較少且有彌散現(xiàn)象；適當延長退火時間，擴增條帶逐漸增加，特異性帶擴增效率增高，彌散現(xiàn)象逐漸消失；但如果退火時間繼續(xù)延長可能增加錯誤匹配的可能性和引發(fā)錯誤雜交，會增加非特異性帶的擴增，降低特異性帶的擴增效率，特異性條帶變?nèi)?。退火時間為30 s時，擴增條帶完整清晰（圖8），因此，本實驗退火時間為30 s。

2.5 循環(huán)次數(shù)對枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系的影響

循環(huán)次數(shù)對擴增產(chǎn)物的量具有重要影響，且不同植物、不同PCR適合的循環(huán)次數(shù)不同。循環(huán)次數(shù)不夠，獲得的擴增產(chǎn)物少，部分特異性譜帶不能得到有效擴增；過多的循環(huán)次數(shù)可導致發(fā)生錯配的比例上升，容易擴增非特異性的產(chǎn)物，引起彌散現(xiàn)象，對試驗結(jié)果進一步分析造成干擾。本實驗研究了30、35、40次循環(huán)對枇杷AS-PCR反應(yīng)的影響，電泳圖譜如圖9所示，30次循環(huán)時，擴增產(chǎn)物不足，條帶弱且有缺失；35次循環(huán)擴增譜帶亮度高，清晰度好；而40次循環(huán)時出現(xiàn)了一些非特異性譜帶，同時有彌散現(xiàn)象，條帶不清。因此確定35次循環(huán)為本實驗的最適反應(yīng)循環(huán)參數(shù)。

通過實驗分析，優(yōu)化枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系，在25 μL反應(yīng)體系中，含10×buffer2.5 μL，Mg2+2.0 mmol·L-1，Taq酶1.5U，引物0.5 μmol·L-1，模板80 ng，dNTPs0.4 mmol·L-1。反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸1 min，35次循環(huán)；72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。

2.6 ‘大五星枇杷S基因型確定及新S-RNase基因的鑒定

采取上述優(yōu)化體系，用上述兼并引物對‘大五星、‘早鐘6號和‘龍泉5號3個品種進行AS-PCR擴增結(jié)果如圖10所示，擴增譜帶清晰，能有效擴增S等位基因特異性譜帶。在‘大五星中擴增出的600～700 bp譜帶進行回收與克隆，測序后獲得654 bp的序列，Blast同源序列檢索表明，該序列與已登記的枇杷屬植物S2等位基因（GenBank： GU384665.1）同源性為99%，在GenBank上的登錄號為JQ228451。

此外，核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，‘大五星中擴增出的768 bp譜的序列（暫命名為SX）與GenBank中枇杷S1-RNase基因（GenBank： EU442285.1）的核苷酸序列同源性為96%。由推導氨基酸序列比對分析（圖 11）可知，Sx與S1-RNase共有10處氨基酸替換及4處氨基酸插入，其中2處氨基酸替換及所有氨基酸插入位置為鑒定S基因的HV區(qū)，因此可以確定Sx為枇杷的新S基因，命名為S41-RNase（GenBank： JX217035），并確定‘大五星的S基因型為S2-S41。

3 討 論

AS-PCR方法在鑒定薔薇科植物的S-RNase 基因中得到廣泛的應(yīng)用[3]。雖然與RADP、ISSR與S-SAP等PCR反應(yīng)一樣，AS-PCR反應(yīng)受體系各成分濃度、引物退火溫度與時間、循環(huán)次數(shù)等反應(yīng)程序因素的影響[6]，但AS-PCR是根據(jù)等位基因多態(tài)性設(shè)計一系列等位基因特異引物進行的PCR擴增[10]，其擴增譜帶較少且具有特異性，對影響反應(yīng)的因素變化更為敏感。本實驗中Mg2+濃度對擴增結(jié)果影響最大，其次是dNTPs濃度，雖然dNTPs是PCR反應(yīng)的原料，但從篩選出的最適濃度來看，dNTPs的濃度較低為設(shè)置的最小水平0.4 mmol·L-1，其濃度升高可能降低了反應(yīng)液中自由Mg2+的濃度而影響了酶的活性，從而影響了擴增結(jié)果[11]。

S基因特異PCR一般分別以多個等位基因的保守區(qū)和某一S基因的多態(tài)位點設(shè)計兼并引物和特異引物，引物間GC含量差異較大，且引物序列長度不一。因此對引物的最適退火溫度進行篩選十分重要，本研究采用溫度梯度PCR方法尋找所用引物組合的最適退火溫度，表明在一定的溫度范圍內(nèi)，退火溫度低擴增的條帶多，非特異帶較多，不利于特異條帶的回收，溫度升高非特異擴增減少，特異帶擴增增強，這與付燕等[9]和胡甦等[11]在ISSR反應(yīng)體系中的研究結(jié)果一致。

本研究采用正交設(shè)計對影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素水平進行綜合篩選，運用得到的優(yōu)化體系對‘早鐘6號、‘大五星和‘龍泉5號 3個品種進行了S等位基因進行了擴增，得到的擴增譜帶清晰且穩(wěn)定，重復性好，擴增出的S等位基因特異條帶整齊性較好，有利于進一步開展回收及克隆工作。本研究基于梨S等位基因保守序列設(shè)計引物建立的枇杷屬植物AS-PCR反應(yīng)體系填補了枇杷屬植物S等位基因特異PCR快速鑒定的技術(shù)空白，為枇杷屬植物種、品種S基因的快速鑒定及序列分析奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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