楊志堅(jiān)　馮金玲　陳輝

摘 要： 【目的】為了建立錐栗再生體系，【方法】以錐栗胚為外植體，分析不同基因型、基本培養(yǎng)基及激素組合對錐栗不定芽的誘導(dǎo)、增殖和生根的影響?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，油榛是錐栗組織培養(yǎng)最佳的基因型；錐栗不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為M（NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO3 1011 mg·L-1 +FeSO4·H2O 27.8 mg·L-1 + 1/2MS 其余無機(jī)鹽 + MS有機(jī)）+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1，其出芽率為76%；芽增殖的最佳培養(yǎng)基為M（同上）+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1，其增殖倍數(shù)達(dá)18；誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為M（同上）+IBA 0.5 mg·L-1，其生根率為48%?！窘Y(jié)論】運(yùn)用上述體系可獲得完整錐栗再生植株。

關(guān)鍵詞： 錐栗； 組織培養(yǎng)； 植株再生

中圖分類號：S664.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪01-0105-05

錐栗（Castanea henryi）屬殼斗科栗屬，是我國著名的木本果材兼用樹種。其人工林主要集中在閩北和浙南，已成為閩北地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)林樹種之一[1]。錐栗果實(shí)外形光潔美觀、果肉細(xì)嫩香甜， 含有淀粉、糖、蛋白質(zhì)等主要營養(yǎng)成分及18種鈣、鋅、磷、鉀、鐵等礦物質(zhì)，深受消費(fèi)者青睞，在國際市場中具有強(qiáng)大的競爭力。錐栗栽培品種多且亂，為了保持其優(yōu)良特性，目前繁殖大部分采用扦插、嫁接等無性繁殖方法，但扦插受限于生根率和優(yōu)質(zhì)插條的數(shù)量，嫁接受砧木與接穗親和力、接穗數(shù)量和生活力以及生長環(huán)境等因素的影響，同時扦插和嫁接出苗周期長，造成它們擴(kuò)繁速度慢，育苗效率低，在種質(zhì)資源有限的條件下不能滿足錐栗良種的大量推廣[2]。而組織培養(yǎng)快速繁殖苗木，不僅可以加速良種繁育，而且在離體條件下群體大，實(shí)驗(yàn)條件易于控制，不受時間和季節(jié)的限制，并在一定程度上保持母本的優(yōu)良性狀。近來學(xué)者對錐栗的生理生化、良種繁育、生態(tài)、栽培技術(shù)、病蟲害、加工利用等方面開展了研究[3]，但對錐栗組織培養(yǎng)的研究相對較少，迄今為止，未見錐栗再生體系建立的研究報(bào)道[4-5]。我們進(jìn)行錐栗組培快繁技術(shù)和再生體系的研究，旨在為遺傳改良研究提供基礎(chǔ)和進(jìn)一步加快錐栗優(yōu)良品種的推廣應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料

14個錐栗品種均來自福建省建甌市水源鄉(xiāng)，每份材料采集健康飽滿的種子 200 粒。

1.2 方法

1.2.1 無菌外植體的建立 將錐栗種子放在流水中沖洗 10 min，剝?nèi)ス麣?，取出種仁，經(jīng) 70% 酒精浸潤 30s 左右，移到含有吐溫 80 的 0.2%HgCI2 溶液中消毒 8 min，接著用無菌水搖洗4～5遍，每次搖洗時間不少于 1 min，放到滅菌濾紙上， 吸干表面水分[5]。在超凈工作臺上用解剖刀切開種仁，取出種胚接種到初代培養(yǎng)基上。

1.2.2 基因型篩選 將14個供試材料（表1）的成熟胚為材料，消毒后，接種于MS+BA1 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1 培養(yǎng)基中[5]，其中蔗糖 40 g·L-1，瓊脂 7g·L-1，pH 為 5.5。每處理接 50 個外植體，重復(fù) 3 次。接種材料置于溫度 （26±1）℃，空氣相對濕度 50%～60%，光照 12 h·d-1，光照度為1 500～2 000 lx。30 d 后統(tǒng)計(jì)分化率，觀察材料狀態(tài)。

1.2.3 基本培養(yǎng)基 以油榛的成熟胚為材料，消毒后，接種于按無機(jī)鹽和有機(jī)鹽含量高低選取White、WPM、MS、1/2MS（1/2的大量元素）、改良 MS 以及 M（NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO3 1 011 mg·L-1+ FeSO4·H2O 27.8 mg·L-1+ 1/2MS 其余無機(jī)鹽 + MS有機(jī)） 這 6 種基本培養(yǎng)基作為錐栗胚誘導(dǎo)、分化、增殖的基本培養(yǎng)基，分別加入激素 BA 1 mg·L-1和 NAA 0.5 mg·L-1，其余條件同上。1 個月后觀察。

1.2.4 叢生芽誘導(dǎo) 以油榛的成熟胚為材料，消毒后，取無菌胚接種于培養(yǎng)基上?；九囵B(yǎng)基為M，添加不同的分裂素濃度 6-BA（1、2 、0.5 mg·L-1），不同類型的生長素 （IAA、NAA、IBA） 及不同濃度的 IBA（0.1、0.2、0.5 mg·L-1）[4]進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。其余條件同上。1 個月后觀察。

1.2.5 不定芽的增殖 將初代培養(yǎng)的芽長至 5～6 個葉芽時，分割，接入增殖培養(yǎng)基。以 M 為基本培養(yǎng)，蔗糖 30 g·L-1、瓊脂 6 g ·L-1，pH 5.5，附加 6-BA（0.25、0.5、1 mg·L-1）、IBA（0.1、0.2、0.3 mg·L-1）、0.1 mg·L-1（IAA、NAA、IBA）進(jìn)行激素組合實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件同上。觀察記錄，30 d 后繼代1次。

1.2.6 生根培養(yǎng) 不定芽伸長至2.0～3.0 cm時自基部切下，移至生根培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基為White、1/2 MS、M。蔗糖 30 g·L-1，瓊脂 6 g·L-1， pH5.5，附加 IBA（0.3、0.5、0.7 mg·L-1）、0.5 mg·L-1（IAA、NAA、IBA）、0.1 mg·L-1 6-BA 進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)30 d 后，記錄試驗(yàn)結(jié)果，觀察記錄每個組合不定芽的生根狀況及芽的生長反應(yīng)情況。生根率（%）=生根苗數(shù)量/外植體數(shù)量×100。

1.2.7 煉苗及移栽 移栽時選擇粗壯、均一、長勢好，無變異的試管苗，先移到自然光的環(huán)境中煉苗 2 d，再開口煉苗 2 d 后移栽。在瓶內(nèi)倒入適量清水，搖動使培養(yǎng)基與幼苗分離，用鑷子把幼苗取出，迅速用水沖洗粘附在根部的培養(yǎng)基，移植于沙質(zhì)中，用 1/2MS 溶液保濕培養(yǎng) 15 d 后，移栽到營養(yǎng)土中正常栽培管理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對錐栗不定芽誘導(dǎo)的影響

將 14 個供試材料的胚外植體消毒后，接種于 MS+BA1 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1分化培養(yǎng)基中， 7 d 左右外植體膨大，14 d 左右可見綠色的芽點(diǎn)（圖版-A），1 個月后14個品種的芽分化率為 0.12～0.72，品種之間存在著明顯差異（表 1），長勢見（圖版-B）?！畨晤^子、‘歐寧子、‘處署紅的長勢最差，‘油栗子、‘烏榛長勢在 14 個品種中最好。綜合外植體分化率和長勢，得出‘油榛是最好的實(shí)驗(yàn)材料。

2.2 基本培養(yǎng)基對錐栗不定芽的影響

以‘油榛胚為材料，選用附加激素的 6 種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，1 個月后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表 2）發(fā)現(xiàn)，芽分化率 0.32～0.84，差異明顯。同時分化出的不定芽長勢差異也較大，White、1/2MS 培養(yǎng)基芽勢弱，MS 分化出的不定芽壯且伴有大量愈傷組織生長，WPM、改良 MS 褐變嚴(yán)重，M 培養(yǎng)基分化出的不定芽壯，但伴有少量愈傷組織。

2.3 不同激素組合對錐栗不定芽分化誘導(dǎo)的影響

以‘油榛的胚為材料，以M為基本培養(yǎng)基，分別附加不同激素組合進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，每處理 50 個外植體。1 個月后觀察不定芽分化率（表3）， 1.0 mg·L-1 6-BA 與0.5 mg·L-1 IBA 組合時分化率最高，其次分別為 0.5 mg·L-1 NAA 和 0.5 mg·L-1 IAA。在IBA為 0.5 mg·L-1，2 mg·L-1的 6-BA 分化率高于 1 mg·L-1的6-BA的分化率。在 6-BA 為 2.0 mg·L-1，IBA 為 0.2 mg·L-1 時，胚不定芽分化率最高，達(dá)到 92%。

故不定芽分化的培養(yǎng)基為 M+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖4.0%+瓊脂粉0.6%，pH 5.5。

2.4 不同激素組合對錐栗不定芽的增殖的影響

將不定芽分別接種含有不同激素種類及其配比的 M 培養(yǎng)基中，進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，每個處理50 個外植體，一個月后觀察（圖版-C，D，表4）。各個處理之間的增殖倍數(shù)變化幅度大，為1～18，其中倍數(shù)最高的是6-BA 0.5 mg·L-1 和IBA 0.1 mg·L-1的組合。從生長狀況看，不同類型的生長素對芽生長影響不同，IBA 增殖的芽正常，IAA 促進(jìn)節(jié)間伸長，NAA 有利于根毛分化；高濃度的分裂素促進(jìn)愈傷形成；適當(dāng)濃度的IBA 有利于不定芽的增殖。

故芽增殖的最優(yōu)培養(yǎng)基為 M+6-BA0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖3.0%+瓊脂粉0.6%，pH 5.5。

2.5 不同激素組合對錐栗不定芽的生根的影響

將不定芽分別接種M基本培養(yǎng)基中，每處理 50 個外植體。 15 d 左右不定根開始形成，1 個月后形成發(fā)達(dá)根系（圖版-E，F(xiàn)），并觀察其生根率和根的生長狀況（表5）。從整體上看，錐栗的生根率比較低。3種基本培養(yǎng)基生根率最高的是M，其次是 1/2MS，最低的是 White 基本培養(yǎng)基，為0。從根的生長狀況看，M基本培養(yǎng)基生根質(zhì)量最好。在錐栗生根中，分裂素起抑制作用，生根率為 0。3種生長素的生根作用存在著差異，生根率最高的是 IBA，且根系質(zhì)量也最好；最低的是NAA為 0.12。不同濃度 IBA 對生根影響也有明顯差異，過高或過低都不利于錐栗不定芽的生根。

綜上所述，最優(yōu)生根培養(yǎng)基是 M +IBA0.5 mg·L-1+蔗糖3.0%+瓊脂粉0.6%，pH 5.5。

2.6 移栽成苗

移栽時，選擇根長 3 cm 左右，粗壯、均一、長勢好，無變異的試管苗，先移到自然光的環(huán)境中煉苗 2 d，再開口煉苗 2 d 后移栽。在瓶內(nèi)倒入適量清水，搖動使培養(yǎng)基與幼苗分離，用鑷子把幼苗取出，迅速用水沖洗根部，移植于沙質(zhì)中（圖版-G），用 1/2MS 溶液保濕培養(yǎng) 15 d 后，移栽到營養(yǎng)土中正常栽培管理。成活率 75%。

3 討 論

前人[6-8]報(bào)道，基因型的選擇對于能否獲得再生植株十分重要。本研究得到，以胚為外植體，錐栗不同品種在不定芽誘導(dǎo)和分化中存在明顯差異。‘油榛分化率最高，達(dá)到 0.72；‘壩頭子最低，僅為 0.12。這是因?yàn)殄F栗不同品種遺傳控制再生能力或?qū)φT導(dǎo)條件的要求不同存在差異[9]，從而造成了不同基因型供體植株發(fā)育狀態(tài)的差異。

基本培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)重要的基質(zhì)，由于各種植物的遺傳特性，生物學(xué)特性和生態(tài)學(xué)特性不一樣，因而各種植物需求的營養(yǎng)成分也不盡相同，對培養(yǎng)基成分要求也有差異[10]，同時器官發(fā)生的不同時期對培養(yǎng)基的要求是不一樣的[11]。本課題組在錐栗組織培養(yǎng)初期得出，適合錐栗胚分化的基本培養(yǎng)基是 White[4]，但本次試驗(yàn)得出錐栗組織培養(yǎng)最適宜的基本培養(yǎng)基為M。這是因?yàn)殡m然 White 基本培養(yǎng)基中的分化率很高，但芽的質(zhì)量不好，有可能是 White 基本培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量低有利于胚分化，有機(jī)質(zhì)含量不高造成芽生長不好。而M基本培養(yǎng)基用有機(jī)質(zhì)含量高的 MS作基礎(chǔ)降低大量元素含量，即 NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO31011 mg·L-1 + FeSO4·H2O 27.8 mg·L-1+ 1/2MS 其余無機(jī)鹽 + MS有機(jī)。因此是最適宜的基本培養(yǎng)基是 M。同時也說明錐栗組培適合于總鹽量中等及銨態(tài)氮和硝態(tài)氨的比值為1的培養(yǎng)基。

在木本植物器官發(fā)生過程中，細(xì)胞分裂素和生長素對芽的誘導(dǎo)和生長發(fā)育均起著重要的作用，一般誘導(dǎo)不定芽的形成時細(xì)胞分裂素高于生長素的用量或只用細(xì)胞分裂素；而誘導(dǎo)不定根發(fā)生只用生長素或配合使用較低濃度的細(xì)胞分裂素[12]。本試驗(yàn)結(jié)果也類似，芽分化中 6-BA 2.0 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1組合效果好，芽增殖實(shí)驗(yàn)中 6-BA0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1的組合效果最好。生根激素 IBA0.5 mg·L-1。在激素配比中，分裂素與生長素的比例為 10 時，錐栗分化不定芽效果最好；比例為 5 時，增殖效果最好；但分裂素對錐栗不定芽生根有抑制作用。這有可能是因?yàn)殡S著繼代次數(shù)的增多，激素的含量和比例相對降低[13-14]，且由于有不同種類植物激素的生理效應(yīng)相互促進(jìn)和相互拮抗，影響植物生理生化的合成、運(yùn)輸、代謝及效應(yīng)導(dǎo)致每一個培養(yǎng)階段只需一定范圍的濃度和配比[15]。在 6-BA 與不同類型的生長素組合中，IBA 對錐栗組織培養(yǎng)效果最好，其次是 NAA，最后是 IAA。這也許是IAA是一種內(nèi)源激素，在外界環(huán)境中易分解的原因[16-17]。

在錐栗組織培養(yǎng)研究過程中也存在一些問題。首先錐栗不定芽分化率不高。這有可能是因?yàn)殄F栗為多年生的木本植物，次生代謝旺盛且復(fù)雜，易導(dǎo)致組培過程中發(fā)生褐變。本實(shí)驗(yàn)通過基因型選擇和基本培養(yǎng)基中大量元素的調(diào)節(jié)，在保證有效的控制褐變的前題下，提高不定芽分化率。其次生根率低，是因?yàn)殄F栗本身就是難生根的物種[1]，而且對于木本成年樹來說，不定芽生根的問題是整個培養(yǎng)過程中最難克服的[18]。（本文圖版見插3）

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